LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
TEKNIK SPREAD, TEKNIK ISOLASI DAN TEKNIK PEWARNAAN
Oleh :
Ade Kurniawan
K2D 007 003
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
JURUSAN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2008
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah
Pada masa sekarang ini kegunaan akan sejumlah mikrobiologi juga dirasakan sangat penting. Kebutuhan akan pengetahuan berbagai macam teknik penelitian tentang mikrobia dirasakan sangat penting. Maka perlu adanya pengajaran – pengajaran berbagai macam teknik penelitian tentang mikrobia sehingga dapat diambil manfaat untuk kemashalatan bersama.
Pada praktikum kali ini para praktikan akan melakukan sejumlah kgiatan praktikum, antara lain : Uji sensitivitas, Penghitungan jumlah mikrobia, Teknik pengencran, teknik pewarnaan dan teknik isolasi mikrobia.
Dalam praktikum Mikrobiologi ini harus didukung oleh sarana dan prasana yang memadai, baik itu alat – alat laboratorium maupun asisten praktikum. Harapannya ketika nanti praktikum didukung oleh sarana dan prasana yang berkualitas, maka ilmu yang disampaikan ketika praktikum akan tersampaikan dengan baik kepada para praktikan.
1. 2. Tujuan Praktikum
1. Praktikan memahami bermacam – macam teknik pewarnaan.
2. Praktikan dapat melakukan, gram, acid fast, pewarnaan endospora, pewarnaan flagella.
3. Praktikan dapat melakukan pengamatan mengenai morfologi bakteri, yeast dan fungi.
4. Praktikan memahami berbagai macam – macam teknik isolasi mikrobia.
5. Praktikan mempunyai keterampilan melakukan isolasi mikrobia.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Teknik Isolasi
2.1.1. Teknik isolasi
Untuk mendapatkan biakan murni, ada bebrapa teknik yang dapat dilakukan yaitu teknik penggoresan agar, teknik agar tuang dan teknik agar sebar. Prinsip ketiga cara ini adalah pengenceran, sehingga nantinya akan diperoleh koloni terpisah yang mengandung satu macam bakteri saja.
1. Teknik Piringan goresan (streak plate methode)
Sebagaimana metode streak culture (piaraan lempengan) pada cara penanaman mikrobia, yaitu dengan menggoreskan ose penginokulasi yang penuh biakan campuran pada permukaan cawan Petri steril, berisi media agar steril yang telah pada. Ada bebrapa metode penggoresan yang berbeda, namun kesemua metose bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organisme pada bebrapa goresan pertama dan menyisakan bahan individual yang cukup terpisah ini akan tumbuh menjadi koloni-koloni bakteri yang saling terpisah satu sama lain. Jadi goresan yang penting untuk diamati pada metode streak plate adalah goresan terakhir, karena dari goresan terakhir didapatkan koloni dari sel tunggal yang benar-benar murni (tidak tercampur spesies lain) yang mudah untuk dipindahkan ke medium steril lain yang berfungsi sebagai media biakan murni sel tunggal yang diperoleh.
1. Teknik Piringan Tuangan (Pour Plate methode)
Dilakukan dengan cara menuang bakteri kedalam cawan Petri steril lalu ditambahkan media agar diatasnya. Kemudian diputar hingga bercampur antara agar dan media.
Teknik isolasi digunakan untuk mengetahui karakteristiks suatu bakteri sehingga dapat memudahkan pengamatan. Biasanya teknik isolasi tidak lepas dari alat – alat yang digunakan seperti jarum ose, Bunsen dan tabung reaksi dengan agar sebagai medianya. Karakterisasi isolat bakteri dilakukan melalui pengujian ciri-ciri morfologi sel dan koloni, serta reaksi fisiologi dan biokimianya menggunakan teknik baku yang telah digunakan untuk masing-masing mikrobia (Lapage et al., 1970; McGinnis et al., 1974; Sly, 1983). Karakterisasi jamur dilakukan terutama berdasarkan ciri-ciri morfologi hifa, miselia, spora, dan konidia menggunakan binokuler dan mikroskop.
( M. Machmud dkk., 2002 )
2.2. Teknik Pewarnaan
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
2.3 Morfologi Bakteri, Yeast dan Fungi
2.3.1 Pengertian Bakteri dan Habitatnya
Menurut Waluyo (2004), bakteri berasal dari bahasa Yunani “bacterian” yang berarti batang atau tongkat. Sekarang digunakan untuk menyebut sekelompok mikroorganisme bersel satu, tubuhnya bersifat prokariotik yaitu tubuh terdiri atas sel yang tidak mempunyai pembungkus inti.
Menurut Suriawiria (2005), bakteri umumnya berbentuk satu sel/sel tunggal atau uniseluler, tidak mempunyai klorofil, berkembang biak dengan pembelahan sel atau biner. Karena tidak mempunyai klorofil, bakteri hidup sebagai jasad yang saprofitik ataupun sebagai jasad yang parasitic. Tempat hidupnya tersebar dimana-mana, mulai dari udara, di dalam tanah, air, pada bahan makanan, tumbuhan ataupun pada manusia dan hewan.
2.3.2 Morfologi Bakteri
* Bentuk bakteri
Menurut Waluyo (2004), secara garis besar tubuh (morfologi), bakteri dapat dikelompokkan ke dalam 1 golongan, yaitu :
a. Basil
Mempunyai bentuk tongkat pendek/batang kecil dan silindris, dan sebagian la berbentuk basil. Berdasarkan jumlah koloni, basil dapat dibagi menjadi :
- Monobasil (monobacillus) yakni basil yang hidup menyendiri/tidak bergerombol. Misal : Salmonella typhi
- Diplobasil (diplobacillus), bila koloni basil terdiri dari 2 basil. Misal : Klensiella pneumonia
- Streptobasill (streptobacillus), bila koloni bakteri berbentuk rantai. Misal : Bacillus anthracis
b. Cocus
Mempunyai bentuk seperti bola-bola kecil. Berdasarkan jumlah koloni, kokus dapat dibedakan menjadi :
- Monokokus : bila kokus hidup menyendiri. Misal : Neiseria gonorhoe, penyebab kencing nanah.
- Diplokokus : bila kokus membentuk koloni terdiri dari 2 kokus. Misal : Diplococcus pneumonia, penyabab radang paru-paru.
- Streptokokus, bila koloni seperti rantai, missal : Streptococcus pyogenes.
- Stafilokokus : bila koloni bakteri seperti buah angggur, missal bakteri Sarcina ventriculi.
- Terrakokus, bila koloni terdiri dari 4 kokus, missal Pediococcus cerevisiae.
c. Spiral (spirilum)
Spiral merupakan bakteri yang terbentuk bengkok seperti spiral. Bakteri yang berbentuk spiral sangat sedikit jenisnya dan merupakan golongan terkecil. Bentuknya terbagi menjadi 3, yaitu :
- spiral, misal Spirillum sp
- vibrio, bentuk koma missal Vibrio cholerae
- spiroseta, bentuk spiral yang dapat bergerak missal Borrelia anserine
* Ukuran Bakteri
Pada umumnya ukuran tubuh bakteri sangat kecil dan baru dapat dilihat jelas dengan mikroskop perbesaran 2x atau lebih. Satuan ukuran tubuh bakteri adalah micrometer. 1 m = 1/1000 mm. Lebar tubuh 1-2 m, panjang 2-5 m. Bakteri kokus ada yang berdiameter 0,5 m sampai 2,5 m. Oleh karena pengukuran besar kecilnya bakteri perlu didasarkan pada standar yang sama. Pada umumnya bakteri yang berumur 2-6 jam lebih besar daripada bakteri yang umurnya lebih dari 24 jam (Waluyo, 2004).
Sel bakteri amat beragam panjangnya, sel beberapa species dapat berukuran 100x lebih panjang daripada sel species yang lain. Satuan ukuran bakteri adalah micrometer. Bakteri yang paling umum dipelajari dalam praktikum mikrobiologi dasar berukuran kira-kira 0,5-1,0 x 2,0-5,0 micrometer. Walaupun bakteri amat kecil ukurannya, namun dapat diukur dengan relative mudah serta tepat. Untuk tujuan ini, mikroskop dilengkapi dengan micrometer ocular, suatu piringan yang diukir dengan garis-garis berjarak sama (Pelzcar and Chan, 1986).
* Struktur Sel Bakteri
1. Struktur Luar
a. Flagel (bulu cambuk)
Mekanisme gerak sebagian besar bakteri dibantu dengan suatu organ yang berbentuk seperti benang yang teramat tipis mencuat menembus dinding sel dan bermula dari tubuh dasar yang disebut dengan flagel. Flagellium terdiri dari 3 bagian yaitu tubuh dasar, struktur seperti kait, dan sehelai filament panjang diluar dinding sel (Pelczar and Chan, 1986).
Menurut Waluyo (2004), berdasarkan tempat kedudukannya dibedakan menjadi :
- Monotrik, flagel hanya 1 di ujung sel
- Lafotrik, banyak flagel di salah 1 ujung sel
- Amfitrik, banyak di kedua ujung sel
- Peritrik, flagel tersebar dari ujung sampai ke sisi sel
- Atrik, tak berflagel
b. Pili (finibrae) sebagai tempat pelekatan sel
Merupakan benang-benang halus yang menonjol dari dinding sel dan hanya terdapat pada bakteri gram negative (Waluyo, 2004).
c. Kapsula / lapisan lender
Menyelubungi dinding sel seluruh bakteri, berfungsi untuk melindungi sel terhadap kehadiran factor luar yang tak menguntungkan dan mengandung karbohidrat (Waluyo,2004).
d. Dinding sel
Fungsinya memberi bentuk bakteri, mengatur keluar masuknya zat kimia dan memegang peranan dalam pembelahan sel. Terdiri atas selulosa, hemiselulosa dan kitin. Dinding sel terletak diantara kapsula dan membrane sitoplasma (Waluyo, 2004).
2. Struktur Dalam
Menurut Waluyo (2004), struktur dalam dari bakteri adalah sebagai berikut :
a. Membran Sitoplasma
Merupakan pembungkus sitiolasma, terletak di bagian bawah dinding sel tetapi tidak terikat satu sama lain dan tersusun atas senyawa protein lipid serta asam nukleat. Berfungsi dalam mekanisme pengangkutan nutrient dan metabolisme dengan bantuan enzim permease.
b. Protoplasma/Sitoplasma/Isi sel/Plasma sel
Merupakan koloid yang mengandung karbohidrat, protein, enzim, belerang, kalsium karbonat dan volutin (zat yang mudah menghisap zat warna tertentu).
c. Inti/nucleus
Nukleus berfungsi sebagai pusat pengendalian sel dan terdiri dari DNA dan RNA.
d. Mesosom
Merupakan lekukan membrane plasma yang relative besar dan biasanya bentuknya tidak menentu. Mesosom ini telah diamati terutama di bagian tipis bakteri gram positif (Volk and Wheeler, 1993).
* Perkembangbiakan Bakteri dengan Spora
Spesies-spesies bakteri tertentu menghasilkan spora, spora diluar sel vegetatif (eksospora) atau di dalam sel vegetatif(endospora).
a. Eksospora
Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal. Streptomyces, misalnya menghasilkan serantaian spora (dikonidia), yang disangga diujung hifa, suatu filament vegetatif (Pelczar and Chan, 1981).
b. Endospora
Merupakan tubuh kecil yang tahan lama yang terbentuk di dalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru. Endospora membentuk dinding yang tebal di dalam sel karena dinding yang sangat tebal ini, endospora tidak dapat diwarnai dengan cara pewarnaan biasa (Volk and Wheeller, 1993).
BAB III
METODOLOGI
3.1. Tempat dan Waktu Praktikum
Hari dan Tanggal : Senin, 29 Oktober 2008
Waktu : Pukul 13.00 wib sampai selesai
Tempat : Laboratorium Terpadu Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
3.2. Alat dan bahan
3.2.1 Isolasi bakteri
Alat
o Bunsen
o Cawan Petri
o Spreader
o Mikropipet
o Tabung Reaksi
Bahan
o Bakteri air laut
o Air Laut steril
3.2.2 Pengecatan
Alat
o Bunsen
o Tabung Reaksi
o Kaca Preparat
o Mikroskop
o Mikropipet
Bahan
o Kristal violet
o Burke’s iodine
o Ethanol
o Safranin Aquose
o Sampel Bakteri (E.Coli)
3.2.3 Pengamatan Morfologi Jamur,Yeast dan Fungi
Alat
o Bunsen
o Tabung Reaksi
o Kaca Preparat
o Mikroskop
o Mikropipet
Bahan
o Sampel bakteri gram positif dan negatif
o Sampel yeast
o Sampel fungi
o Tinta Cina
o Lactofenol
o Methilen Blue
3.3. Cara Kerja
1. Teknik Spread
· Siapkan peralatan : cawan petri, pipet mikro dan spreader yang sudah dalam kondisi steril
· Siapkan bahan air laut steril yang diencerkan : 10-4, 10-5 dan 10-6
· Sterilkan lingkungan dengan menyemprotkan spray di sekitar kawasan kegiatan
· Ambil sampel air laut steril yang diencerkan : 10-4, 10-5 dan 10-6
dengan menggunakan mikro pipet kemudian masukkan ke dalam cawan petri dengan metode aseptic
· Sterilkan spreader dengan alkohol kemudian panaskan dengan Bunsen
· Ratakan sampel air laut steril yang diencerkan : 10-4, 10-5 dan 10-6 pada cawan petri dengan menggunakan spreader dengan metode aseptic.
2. Teknik Isolasi
· Siapkan sampel bakteri
· Siapkan pula alat – alat laboratorium seperti : Bunsen, jarum ose dan alkohol
· Ambil sampel bakteri air laut pada tabung reaksi dengan metode aseptic
· Siapkan pula jarum ose yang sudah dalam keadaan steril
· Goreskan jarom ose pada bakteri yang berada pada tabung reaksi dengan agar miring sebagai media secara aseptic
· Pindahkan goresan jarum ose yang sudah terdapat sampel bakteri ke dalam tabung reaksi yang lain dengan agar miring sebagai medianya secara zig-zag dengan metode aseptic.
· Lakukan cara kerja yang sama pada larutan air laut : 10-4, 10-5 dan 10-6
3. Teknik Pewarnaan
· Ambil aquades sebanyak 100 mikro kemudian teteskan pada kaca preparat
· Ambil sampel bakteri ( E. Coli ) dan letakkan pada preparat
· Panaskan preparat pada Bunsen sehingga air pada preparat menguap dan kering
· Tambahkan gram A ( Cristal Violet ) kemudian tunggu 1 menit
· Semprot preparat dengan aquades sehingga gram A pada preparat hilang kemudian keringkan preparat di sekitar Bunsen
· Tambahkan lugol untuk membentuk kristal yodium violet pada preparat dengan diamkan selama 1 menit
· Bersihkan lugol pada preparat dengan menyiramkan aquades ke preparat
· Semprot preparat dengan alkohol yang berfungsi sebagai cairan pemucat
· Tambahkan safranin pada preparat dan tunggu selama 1 menit
· Semprot preparat dengan aquades sehingga safranin pada preparat hilang
· Keringkan dan amati preparat di bawah mikroskop
· Gambar dan catat hasil
·
- Pengamatan Morfologi bakteri, yeast, dan fungi
1. Bakteri
o Ambil aquades, tuangkan di preparat
o Ambil bakteri 1 mikro liter, letakkan pada preparat
o Ambil tinta Cina dan teteskan ke kaca preparat, lalu keringkan
o Amati dibawah mikroskop
2. Jamur
o Ambil aquades, tuangkan di preparat
o Ambil jamur 1 mikro liter, letakkan di preparat
o Ambil lactofenol dan tetskan ke preparat lalu keringkan
o Amati
3. Yeast
o Ambil aquades, tuangkan di preparat
o Ambil yeast 1 mikro liter, letakkan di preparat
o Ambil Methilen Blue dan teteskan ke preparat lalu keringkan
o Amati dibawah mikroskop
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
1. Tenik Spread
Pada percobaan ini didapatkan cawan petri yang berisikan sampel bakteri pada permukaan cawan petri.
2. Teknik Isolasi
Pada percobaan ini didapatkan tabung reaksi berisikan sampel bakteri air laut : 10-4, 10-5 dan 10-6 dengan agar miring sebagai media.
3. Teknik Pewarnaan
Pada percobaan ini didapatkan hasil pengamatan bakteri ( + ) yang berwarna biru, bakteri ( - ) yang berwarna merah, fungi berwarna transparan dan yeast berwarna biru.
 | |
Gram positif gram negatif
 | |
Yeast fungi
4.2. Pembahasan
1. Teknik Spread
Pada teknik spread ini hal – hal yang perlu diperhatikan adalah kesterilan alat- alat yang digunakan kemudian cara menggunakan spread secara benar dimana menggoreskan sampel bakteri pada permukaan cawan petri dengan perlahan – lahan atau tidak menekannya dengan keras.
Sampel bakteri air laut yang digunakan pun sudah diencerkan menjadi 10-4, 10-5 dan 10-6 dimana semakin encer konsentrasi air laut maka keberadaan bakteri semakin sedikit dan jarang. Berbeda dengan air laut yang belum diencerkan sama sekali dimana terdapat banyak sekali bakteri di dalamnya
2. Teknik Isolasi
Pada teknik isolasi ini tidak jauh berbeda dengan teknik spread yaitu kondisi alat – alat yang digunakan sudah dalam keadaan steril dan di setiap perlakuan harus dilakukan secara aseptic.
Pengambilan bakteri oleh jarum ose pada tabung reaksi dengan agar sebagai medianya harus dilakukan dengan menggores bakteri secara perlahan – lahan sehingga media agar miring tidak rusak.
Maka jika terjadi kerusakan pada agar miring dapat menyebabkan masuknya bakteri ke dalam sela – sela agar miring sehingga mempersulit pengamatan bakteri pada tabung reaksi. Pada saat pemindahan bakteri oleh jarum ose ke dalam tabung reaksi yang lain, dilakukan dengan pola zig – zag sehingga memudahkan dalam pengamatan bakteri di dalam tabung reaksi.
3. Teknik Pewarnaan
Pada teknik pewarnaan ini dilakukan terhadap bakteri. Pada bakteri ( + ) lapisan dinding sel terdiri dari peptidoglikan sedangkan pada bakteri ( - ) lapisan dinding sel terdiri dari lipid. Oleh karena itu pada penyiraman dengan cairan pemucat, warna dinding sel akibat pewarnaan oleh cristal violet pada bakteri ( - ) luntur yang dikarenakan lemahnya daya ikat lipid. Berbeda dengan bakteri ( + ) yang dinding selnya memiliki daya ikat yang kuat karena tersusun dari peptidoglikan.
Pada pengamatan di bawah mikroskop bakteri ( + ) berwarna biru, kemungkinan ini diakibatkan oleh pewarnaan cristal violet ( gram A ) yang menempel pada dinding sel. Kemudian pada bakteri ( - ) berwarna merah, hal ini diakibatkan oleh lemahnya daya ikat lapisan dinding sel sehingga tidak dapat mengikat warna biru oleh gram A.
Pada pewarnaan, bakteri gram positif dan bakteri gram negative memiliki warna yang berbeda ketika diamati dibawah mikroskop. Bakteri gram positif berwarna ungu/violet sedangkan bakterigram negative berwarna merah. Hal ini terjadi akibat bakteri gram positif menyerap warna dari kristal violet dan tidak terlepas pada saat dicuci dengan ethanol/ alcohol karena dinding selnya terbuat dari peptidoglikan yang tidak larut terhadap alcohol/ ethanol.
Sedangkan bakteri gram negative berwarna merah karena tidak menyerap warna dari kristal violet akibat dari pencucian dengan alcohol/ethanol. Penyebabnya adalah dinding sel dari bakteri gram negative yang terbuat dari lemak sehingga larut ketika dicuci menggunakan alcohol/ethanol
BAB V
PENUTUP
5. 1. Kesimpulan
1. Seluruh perlakuan yang dilakukan pada praktikum mikrobiologi harus dengan metode aseptic pun alat – alat yang digunakan harus dalam kondisi steril.
2. Pada teknik spread dibutuhkan keterampilan saat menggunakan spread sehingga sampel bakteri dapat rata di atas permukaan cawan petri.
3. Pada teknik isolasi pun dibutuhkan keterampilan terutama saat menggoreskan bakteri dengan menggunakan jarum ose di dalam tabung reaksi dengan agar miring sebagai medianya.
4. Pada teknik pewarnaan hal – hal yang harus diperhatikan adalah langkah – langkah teknik pewarnaan, mengingat langkah – langkah pada teknik ini cukup panjang.
DAFTAR PUSTAKA
Machmud, M. Sudjadi, dan Yadi Suryadi. Seleksi dan Karakterisasi Mikroba Antagonis. 2002. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian : Bogor.
Lapage, S.P., J.E. Shelton, T.G. Mitchell, and A.R. Mackenzie. 1970. Culture collections and reservation of bacteria. In J.R. Norris and D.W. Ribbons (Eds.). Methods in Microbiology. Vol. 3A. Academic Press, London.
McGinnis, M.R., A.A. Padhye, and L. Ajello. 1974. Storage of stock culture of filamentous fungi, yeast and some aerobic actinomycetes in strerile distilled water.
Volk, W.A and Wheeler M.F, 1993, Mikrobiologi Dasar, Erlangga, Jakarta
www.wikipedia.org/pewarnaan_gram (diakses 30-10-2008 jam 15.00)
Tidak ada komentar:
Posting Komentar