Pengelolaan Koleksi Patogen Tanaman (bag III)

1          ISOLASI JAMUR, BAKTERI DAN NEMATODA DI LABORATORIUM

Setelah kembali dari perjalanan koleksi, spesimen-spesimen sebaiknya segera di pilah-pilah berdasarkan kelompok-kelompok utamanya. Prioritas perlu diberikan kepada spesimen yang cepat memburuk, seperti jamur makro yang berdaging atau spesimen-spesimen yang patogennya harus segera diisolasi dari jaringan tanaman. Contoh-contoh  lainnya yang tidak kena pengaruh yang merugikan bila dibiarkan sesaat misalnya jamur karat dan jamur api, dapat dikeringkan di dalam alat pengepres tanaman, kemudian dibekukan pada suhu -20°C selama 7 hari dan diperiksa kemudian.

Virus tanaman dapat disimpan sementara di dalam desikator, seperti dijelaskan dalam Bab 3.3.1. Virus tanaman tidak dibahas lebih lanjut dalam Bab ini, karena virus tidak secara rutin diisolasi dan dimurnikan (pemisahan partikel virus dari komponen sel tanaman) dalam prosedur diagnostik.

Bakteri dan jamur patogen seringkali harus diisolasi dan dikulturkan dari spesimen tanaman berpenyakit sebelum dapat diidentifikasi. Patogen yang dapat tumbuh saprobik (parasit fakultatif atau nekrotrof) umumnya dapat ditumbuhkan dalam kultur, walaupun beberapa di antaranya memerlukan perlakuan khusus. Isolasi jamur dari material tanaman biasanya dilakukan dengan cara menaruh sepotong kecil jaringan ke dalam media agar-agar yang cocok, misalnya agar-agar air dalam cawan Petri steril. Spora yang diambil secara langsung dari tubuh buah dengan menggunakan jarum steril juga dapat diletakkan di atas permukaan agar-agar.

Banyak jamur dan bakteri saprobik tumbuh pada atau mengkontaminasi jaringan tanaman sebagai pengkoloni sekunder luka penyakit. Oleh karena itu, penting sekali untuk berhati-hati ketika menggunakan teknik steril guna menghindari terjadinya kontaminasi. Sterilisasi permukaan jaringan yang dipotong seringkali diperlukan untuk menghilangkan mikroorganisme saprobik yang biasanya tumbuh di permukaan tanaman.

Bersihkan permukaan tanaman yang akan dikerjakan, dengan kertas tisu atau kapas yang telah dibasahi dengan etanol 70% dan biarkan mengering. Permukaan yang  halus, keras, dan tidak berpori, misalnya kaca adalah yang terbaik untuk membuat irisan material tanaman. Pinset dan pisau skalpel disterilisasi dengan cara mencelupkannya ke dalam etanol 95% dan melewatkannya dengan hati-hati di atas nyala api. Peralatan sebaiknya tidak dibiarkan terlalu lama di atas nyala api, karena akan rusak. Alkohol sangat mudah terbakar dan perlu sangat hati-hati dengan peralatan nyala api di dekat wadah berisi alkohol. Ose untuk inokulasi disterilkan dengan cara memanaskannya sampai merah dalam nyala api yang panas. Jarum harus dibiarkan sampai dingin sebelum digunakan.

Sterilisasi permukaan material tanaman yang sakit  menghilangkan saprob dan memungkinkan bakteri atau jamur patogen untuk tumbuh tanpa gangguan bila material dilapiskan pada agar-agar. Etanol (70%) yang digunakan untuk menyeka permukaan atau merendam dapat mensterilkan seluruh permukaan. Tidak diperlukan pencucian pasca perlakuan, karena dapat tanpa dibakar atau dibiarkan menguap.

Natrium hipoklorit cair juga banyak digunakan dan sangat efektif sebagai desinfektan. Pemutih komersial mengandung 10–14% klorin tersedia. Ini biasanya digunakan pada pengenceran 10% (mengandung 1–1,4% klorin tersedia) dengan waktu pencelupan 1–5 menit. Larutan ini sebaiknya disimpan di dalam lemari es, karena kemampuannya akan hilang bila disimpan lama. Larutan encer yang baru sebaiknya dibuat lagi setiap 2–3 minggu. Kelemahan larutan hipoklorit adalah memiliki bau yang menyengat, meninggalkan residu, dan merusak pakaian jika terkena tumpahannya.

Prosedur yang tepat yang dipilih untuk isolasi bakteri dan jamur patogen bergantung kepada sifat dasar material tanaman inang dan patogen itu sendiri.

1.1       ISOLASI JAMUR

Prosedur dasar untuk mengisolasi jamur patogen dari jaringan tanaman adalah sebagai berikut:

1. Cucilah contoh jaringan di bawah air leding yang mengalir untuk menghilangkan tanah, debu, dan kontaminan lainnya;
2. Bila contoh terlalu banyak ditumbuhi saprob, sekalah dengan etanol 70%. Hal ini dianjurkan untuk mensterilkan permukaan  jaringan kayu yang sakit;
3. Irislah jaringan dari tepi  utama luka yang berbatasan dengan jaringan  yang sehat;
4. Letakkan irisan-irisan jaringan ke dalam larutan natrium hipoklorit 1% dalam etanol 10%. Hal ini perlu disesuaikan bergantung kepada sifat jaringan, karena misalnya, beberapa jaringan daun sangat berpori dan mungkin dapat mengabsorbsi cukup banyak larutan sterilan untuk dapat mematikan patogen. Waktu pencelupan  untuk sterilisasi biasanya antara 1–5 menit;
5. Keluarkan irisan-irisan jaringan dari larutan untuk mensterilisasi dan cucilah dengan cara memindahkannya sebentar ke dalam air suling steril. Kemudian irisan-irisan tersebut sebaiknya dikeringkan di atas kertas saring steril, apabila memungkinkan, dilakukan di udara yang disaring dalam ruang isolasi (laminar flow), sebelum mengiris potongan jaringan kecil  (kira-kira 2 mm x 2 mm) yang dilapiskan pada agar-agar air leding atau agar-agar dekstrosa kentang. Pengeringan penting, karena menghambat pertumbuhan bakteri kontaminan. Ketika melapiskan potongan jaringan pada media agar-agar, tutup cawan Petri sebaiknya diangkat dan ditaruh kembali dengan hati-hati untuk menghindari masuknya kontaminan yang berasal dari udara;
6. Pelat isolasi sebaiknya diinkubasi dengan posisi terbalik untuk mencegah kondensasi uap air pada permukaan agar-agar. Kebanyakan jamur patogen tumbuh dengan baik pada suhu 25°C;
7. Kultur murni dapat diperoleh dari koloni yang berasal dari spora tunggal atau dari ujung hifa yang terdapat pada pelat isolasi awal.  Kultur spora tunggal dapat dibuat dengan menyiapkan suspensi spora dalam air suling steril dan disebarkan di atas agar-agar air leding atau media lain yang sesuai. Pelat-pelat ini kemudian diinkubasikan di dalam ruang gelap pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya pelat-pelat itu diperiksa di bawah mikroskop stereo dan spora-spora tunggal yang berkecambah pada sepotong kecil agar- agar dipindahkan dengan jarum inokulasi ke media yang sesuai; 
8. Prosedur tersebut di atas dapat dimodifikasi  sesuai dengan pengalaman atau mengikuti petunjuk yang tercantum dalam pustaka.

Dari daun

Pilihlah daun dengan bilur baru,  karena jamurnya dalam keadaan paling aktif. Secara hati-hati, irislah potongan kecil jaringan dari bagian tepi bilur dengan gunting atau skalpel steril. Sterilisasi permukaan material daun biasanya perlu dilakukan, 1–3 menit dalam larutan natrium hipoklorit 10%, dilanjutkan dengan pembilasan dengan air steril. Selanjutnya, potongan-potongan daun ditaruh pada permukaan agar-agar dengan menggunakan pinset steril.

Dari batang

Bila terdapat bilur yang dalam atau bilur di bagian dalam jaringan pembuluh, contoh  dapat diambil dari jaringan bagian dalam untuk menghindari diperlukannya sterilisasi permukaan. Contoh dibelah membujur dari bagian yang sehat ke arah bagian yang sakit dengan menggunakan pisau yang telah dibakar atau dengan alat lain yang sesuai  untuk material berkayu.

Dengan menggunakan skalpel steril,  pindahkan jaringan-jaringan dengan hati-hati dari tepi utama luka ke permukaan bagian dalam yang baru disingkap. Dengan menggunakan pinset steril pindahkan potongan  jaringan yang panjangnya 3–5 mm ke cawan Petri yang berisi media agar-agar air leding atau media agar-agar lain yang sesuai. Pada batang yang tipis, biasanya bilur terbatas pada jaringan luar, atau tidaklah  mungkin untuk mengambil contoh jaringan bagian dalam. Dalam hal ini, potongan-potongan kecil jaringan sebaiknya diambil dari tepi bilur dengan menggunakan skalpel steril, permukaan disterilkan (1–3 menit dalam natrium hipoklorit 10%), dicuci dengan air steril, dan disimpan pada permukaan agar-agar.

Dari akar

Cucilah akar-akar yang kecil dan halus untuk menghilangkan tanah yang berlebihan, kemudian taruhlah di dalam mangkuk yang bagian dasarnya rata atau cawan Petri berisi 2–3 cm air, sehingga bagian akar yang berpenyakit mudah dilihat. Pisahkan akar-akar itu  dengan skalpel atau sepasang pinset. Selanjutnya, potonglah bagian akar yang mengarah ke tepi luka/bilur (sebaiknya panjangnya sekitar 5 mm) dengan  menggunakan skalpel atau gunting steril. Sterilisasi permukaan juga dapat dilakukan sebentar, tetapi dengan material yang  halus seperti itu, cara pencucian yang lama mungkin yang terbaik. Hal ini dapat dilakukan dengan menaruh potongan-potongan  akar dalam saringan yang halus di bawah air leding bersih yang mengalir secara perlahan selama 30–90 menit. Selanjutnya, dengan menggunakan skalpel atau sepasang pinset steril, pindahkan potongan akar ke cawan Petri yang berisi media TWA (atau media agar-agar lain), dengan menaruh potongan-potongan ke dalam permukaan agar-agar.

1.1.1        Wadah lembab

Kadangkala gejala penyakit tampak jelas, tetapi patogen penyebabnya ternyata sulit diisolasi. Bila hal ini terjadi, material  tanaman dapat diinkubasi di dalam wadah lembab untuk merangsang pembentukan tubuh buah dan sporulasi. Kendalanya, saprob yang terdapat pada permukaan tanaman juga  dirangsang pertumbuhannya. Penyekaan permukaan material sekilas dengan alkohol teknis atau larutan natrium hipoklorit 10% mungkin dapat menolong, tetapi dapat merusak struktur permukaan patogen yang ada. Cara lain, spesimen dapat juga dicuci dengan air steril dan dikeringkan sebelum inkubasi.

Wadah lembab sebaiknya diinkubasi pada suhu di bawah 25°C dan yang terbaik disimpan di tempat yang terang, misalnya di meja laboratorium, namun tidak langsung terkena sinar matahari dan pada suhu yang diusahakan tetap untuk menghindari kondensasi. Wadah ini harus diperiksa setiap hari, diamati di bawah mikroskop stereo dengan perbesaran rendah untuk melihat sporulasi. Selanjutnya, struktur  spora dapat dipindahkan dengan menggunakan jarum halus yang steril untuk pemeriksaan mikroskopik yang lebih teliti atau untuk dikulturkan pada media agar-agar.

Cawan Petri dari gelas atau plastik merupakan wadah yang berguna untuk spesimen yang kecil atau datar seperti daun atau ranting. Kotak plastik paling cocok untuk material yang lebih besar, dan material yang sangat besar dapat diinkubasi di dalam kantong plastik besar atau kantong sampah yang telah diautoklaf.

Barang-barang yang digunakan untuk wadah lembab sebaiknya steril. Wadah yang bersih namun tidak steril sebaiknya diseka dengan  alkohol 70% dan dibiarkan sampai kering. Kantong plastik yang digunakan sebaiknya baru. Kertas saring steril (diautoklaf) ditambahkan ke dalam cawan Petri atau kotak wadah dan dilembabkan dengan air suling steril. Kertas tisu penyerap steril yang biasa digunakan di laboratorium cocok  untuk kantong plastik atau kotak plastik besar. Spesimen paling baik disimpan di atas kertas lembab pada potongan-potongan kisi plastik atau benda penopang lain yang serupa; penopang ini disterilisasi dengan mencelupnya dalam alkohol 70% dan dilewatkan  di atas nyala api secara hati-hati.

1.1.2        Teknik pengenceran

Jamur mungkin dapat diisolasi dari tanah dan dari permukaan tanaman, seperti daun dan bunga, dengan cara mencucinya, diikuti dengan melakukan satu seri pengenceran untuk mendapatkan koloni tunggal pada media agar-agar yang sesuai, seperti TWA. Media yang kaya hara harus dihindari, karena  menyebabkan pertumbuhan vegetatif yang berlebihan dengan mengorbankan sporulasi. Antibiotik seperti streptomisin sulfat sebaiknya juga ditambahkan ke dalam media agar-agar untuk menekan pertumbuhan bakteri.

Satu seri pengenceran dalam air steril dapat disiapkan dengan mencuci sedikit tanah atau material tanaman yang telah ditumbuk halus atau disaring yang dicampur rata dalam 10 ml air steril dalam botol McCartney yang berukuran 20 ml. Pipet steril kemudian digunakan untuk memindahkan 1 ml suspensi ini ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air steril. Pipet steril yang baru digunakan untuk mengaduk dan memindahkan 1 ml suspensi ini  ke tabung kedua yang berisi 9 ml air steril.

Proses ini berlanjut sampai jumlah pengenceran yang diinginkan telah siap. Sebagian kecil hasil pengenceran terakhir dipindahkan ke dalam cawan Petri steril berisi agar-agar dan disebarkan dengan menggunakan batang gelas steril. Cawan Petri itu lalu diinkubasikan sampai koloni-koloni jamur mulai tampak. Koloni-koloni itu harus segera disubkulturkan ke media agar-agar yang sesuai sebelum mereka mulai tumbuh saling menutupi satu sama lain.

Kadangkala  hanya ada sedikit sekali material jamur yang bersporulasi, seperti jamur askomiset atau jamur yang membentuk piknidia. Dalam hal ini, cara yang bermanfaat adalah memindahkan tubuh buah ke dalam setetes air steril pada kaca obyek yang telah dilewatkan di atas nyala api dan menunggu sampai spora dilepaskan. Kerapatan spora dapat dimonitor di bawah mikroskop ganda dan jika dianggap cukup, suspensi digoreskan pada pelat berisi media TWA. Spora tunggal yang berkecambah kemudian dipindahkan ke media tumbuh yang sesuai setelah kira-kira 24 jam.

1.1.3        Pertumbuhan dan sporulasi

Pada kebanyakan jamur patogen, produksi spora merupakan cara reproduksi dan persebaran di habitat alaminya. Kondisi tempat inkubasi kultur jamur akan menentukan seberapa baik jamur itu bersporulasi. Kebanyakan jamur akan tumbuh baik di laboratorium pada suhu kamar. Sporulasi sangat penting dalam identifikasi jamur dan juga diperlukan untuk produksi inokulum bagi uji patogenisitasnya.

Lingkungan yang tidak alami, seperti inkubator yang gelap dan hangat serta media agar-agar yang kaya hara, merupakan kondisi yang tidak baik untuk terjadinya sporulasi pada kebanyakan jamur patogen tanaman. Sporulasi biasanya ditingkatkan dengan penambahan material daun inang yang telah disterilkan, misalnya jerami gandum, daun jagung, daun bunga anyelir, atau media yang  ‘kurus’ seperti TWA.

Banyak jamur dapat dirangsang untuk bersporulasi di bawah lampu ultraviolet (UV) dekat (near ultraviolet light) atau ‘lampu hitam’ (black light). Walaupun ‘lampu hitam’ dapat berpengaruh terhadap pigmentasi, morfologi kasar koloni dan bahkan morfologi spora, namun pengaruh tersebut tidak cukup mengganggu proses identifikasi. Kotak ‘lampu hitam’ dapat dibuat untuk merangsang sporulasi pada jamur yang memerlukan lampu ultraviolet dekat (Gambar 8).

Gambar 8       Bagan penampang melintang untuk membuat lemari ‘lampu hitam’

Berikut ini adalah butir-butir panduan penggunaan ‘lampu hitam’ untuk merangsang sporulasi jamur.

Ø  Lampu TL  ultraviolet dekat (‘lampu hitam’) dapat diperoleh di pasaran dengan ukuran 20 W, 40 W, dan 80 W dengan panjang yang beragam. Lampu TL cahaya siang putih sejuk mengemisi sejumlah tertentu radiasi ultraviolet dekat dan dapat digunakan jika ‘lampu hitam’ tidak dapat diperoleh.  Kombinasi lampu TL, misalnya satu tabung ‘lampu hitam’ di antara dua lampu TL cahaya siang putih sejuk, mungkin dapat digunakan. Sebaiknya jangan menggunakan lampu pijar;

Ø  Siklus berganti  antara perlakuan 12 jam lampu UV dan 12 jam gelap dapat diatur dengan pengatur waktu;

Ø  Beberapa jamur memerlukan periode gelap untuk mulai bersporulasi, oleh karena itu, kotak sebaiknya kedap cahaya;

Ø  Pencahayaan ‘lampu hitam’ sebaiknya dimulai 1–4 hari setelah inokulasi kultur dan dilanjutkan sampai akhir pertumbuhan. Pencahayaan kultur dengan ‘lampu hitam’ tidak ada manfaatnya jika jamur tidak memiliki waktu  untuk tumbuh;

Ø  Pada beberapa jamur, pengaruh lampu ultraviolet hilang pada suhu tinggi; dan

Ø  Radiasi ultraviolet dekat ditransmisikan secara efektif melalui cawan Petri plastik dan oleh banyak plastik tidak berwarna lainnya.

1.2       ISOLASI BAKTERI

Jika bakteri merupakan patogen utama, sel-sel bakteri dapat ditemukan dalam jumlah besar bila material dipisahkan dari bagian tepi bilur yang sedang berkembang atau jaringan pembuluh yang berubah warna. Prosedur dasar untuk menemukan adanya dan mengisolasi bakteri patogen dari jaringan tanaman adalah sebagai berikut:

1.      Cucilah contoh jaringan dengan air leding yang mengalir untuk menghilangkan tanah di permukaan, debu, dan kontaminan lainnya. Bila material tanaman asal belum ditangani secara berlebihan, maka sterilisasi permukaan tidak diperlukan. Sterilisasi tidak diinginkan, terutama untuk material yang hampir kering atau sudah kering. Hal ini karena zat sterilan cepat menembus jaringan, yang dapat mematikan semua bakteri secara efektif. Jika diperlukan, pencelupan singkat dalam larutan natrium hipoklorit 10% sudah cukup untuk mensterilkan sebagian besar material.  Setelah perlakuan tersebut, contoh sebaiknya dibilas dengan air steril. Jika contoh berupa bagian tanaman yang lebih tebal, seperti kuncup, buah, kanker dan nyali, maka sebelum isolasi, bagian tanaman ini dicelupkan ke dalam etanol 70% dan dilewatkan di atas nyala api.

2.      Buatlah irisan yang bersih dari potongan jaringan yang dipilih dari batas antara jaringan yang sakit dan yang sehat, kemudian taruhlah ke dalam setetes air steril pada kaca obyek yang telah dilewatkan di atas nyala api. Jaringan- jaringan tanaman yang lebih tebal, setelah ditaruh pada kaca obyek, sebaiknya dipisah-pisah sebelum dilakukan pengamatan mikroskopik. Tutuplah perlahan-lahan dengan kaca penutup yang telah dilewatkan di atas nyala api dan segera amati dengan mikroskop fase kontras pada perbesaran kira-kira 400x. Menurunkan kondensor atau menutup diafragma bawah pentas mungkin perlu dilakukan untuk melihat sel-sel bakteri. Gumpalan bakteri akan mengalir dari bagian tepi potongan, jika bilur itu disebabkan oleh bakteri. Harus hati-hati agar tidak keliru dalam membedakan  material seperti lateks, plastid, atau butir pati dengan bakteri. Jika aliran bakteri dari tepi potongan jaringan terlihat, kaca penutup  dapat dipindahkan dan satu ose penuh suspensi digoreskan pada media agar-agar yang sesuai. Kadang-kadang perlu membiarkan jaringan tanaman di dalam air selama beberapa jam agar cukup banyak sel bakteri keluar dari jaringan, sebelum menggoreskan suspensi pada media isolasi.

3.      Penggoresan sebaiknya dilakukan dengan ose platina yang dibuat dari kawat platina 24 SWG dengan menggosokkan ose yang penuh suspensi pada permukaan cawan agar-agar. Ada beberapa cara untuk melakukan hal ini. Cara pertama adalah dengan membuat pola berbiku-biku pada kuadran cawan mulai dari tepi. Kuadran-kuadran berikutnya sebaiknya digoresi masing-masing menutupi kuadran yang terakhir pada bagian tepinya (Gambar 9). Setiap kali sebelum penggoresan, ose sebaiknya dilewatkan di atas nyala api dan didinginkan dengan menyentuhkannya pada permukaan agar-agar. Cara kedua adalah menggoreskan satu ose penuh suspensi pada seluruh permukaan cawan dengan cara menggerakkannya perlahan-lahan dari bagian atas ke bawah dan pada waktu yang  sama menggerakkannya secara cepat dari satu tepi cawan ke tepi yang lain. Tujuan cara-cara ini adalah untuk memperoleh individu-individu koloni bakteri yang terpisah dengan baik.

4.      Media yang digunakan harus sesuai untuk pertumbuhan patogen yang dicurigai. Setelah dituangi agar-agar, cawan media isolasi sebaiknya dikeringkan dengan cara membalik tutup cawan, dan menopang bagian  bawahnya pada tepi tutup yang dibalik selama 24 jam dalam inkubator yang bersih atau dengan cara membuka tutup-tutup cawan media di dalam lemari alir udara (laminar flow) selama 30 menit. Hal ini perlu dilakukan dengan hati-hati untuk menghindari kontaminasi udara pada agar-agar.

5.      Cawan berisi isolat sebaiknya diinkubasi dalam posisi terbalik untuk menghindari terjadinya kondensasi uap air pada permukaan agar-agar. Kebanyakan bakteri patogen tanaman tumbuh baik pada suhu 25–28°C.

6.      Buatlah modifikasi prosedur di atas berdasarkan pengalaman atau seperti yang tercantum dalam pustaka.

Gambar 9       Cawan goresan isolasi bakteri yang memperlihatkan: 1. Inokulasi massa dari suspensi sel. 2. Goresan permulaan dari inokulasi massa dengan menggunakan ose yang dilewatkan nyala api dan didinginkan. 3. Goresan kedua. 4. Goresan ketiga, koloni-koloni tunggal seharusnya tumbuh di areal ini.

Setelah penggoresan, cawan diinkubasi pada suhu ruangan dan diperiksa setiap hari selama 4–5 hari atau sampai dengan 10–14 hari jika patogen yang dicurigai tumbuhnya lambat. Apabila diagnosis dilakukan berdasarkan gejala, patogen yang diharapkan seringkali dapat langsung dikenal dan dibuat sub-kulturnya, walaupun bakteri-bakteri lain juga ada di dalam cawan. Dengan spesimen yang baik dari tanaman yang berpenyakit dan potongan-potongan jaringan yang dipilih dengan baik, seringkali patogen tersebut merupakan satu-satunya organisme yang ditemukan. Bila lebih dari satu tipe koloni yang tumbuh, kerapatan relatif dari masing-masing tipe seharusnya dicatat. Organisme yang paling sering diisolasi, terutama jika diperoleh dari lokasi yang berbeda, perlu diperiksa kembali, kecuali jika dapat langsung dikenal sebagai saprofit. Pembuatan subkultur hanya dapat dilakukan pada koloni yang terpisah dengan baik, dan sebaiknya  pada agar-agar miring dari media yang sama.

Metode isolasi lainnya mirip dengan yang digunakan untuk jamur. Potongan-potongan jaringan terinfeksi diletakkan secara langsung pada media agar-agar, dan pertumbuhan bakteri terjadi di sekitar potongan jaringan. Jika terdapat saprob, maka pertumbuhan mikrob besar kemungkinannya sebagian besar terdiri atas saprob, sehingga patogen yang tumbuhnya lamban akan hilang. Dengan alasan ini, maka metode ini sebaiknya hanya dapat digunakan jika metode pengenceran dianggap tidak sesuai.

1.3       ISOLASI NEMATODA

Nematoda atau cacing gelang tidak beruas adalah kelompok yang beragam, yang kebanyakan merupakan binatang mikroskopik. Mereka sebenarnya dapat ditemukan dalam segala keadaan, baik di tempat yang berair maupun yang hanya kadang-kadang berair. Nematoda memperoleh gizinya dari sumber-sumber yang berbeda,  dan banyak jenisnya merupakan parasit yang sangat khusus. Kebanyakan tanaman dan binatang dapat menjadi inang dari satu jenis nematoda parasit atau lebih. Dengan demikian, banyak nematoda parasit merupakan hama penyakit yang bernilai ekonomi penting. Sebaliknya, jenis-jenis nematoda yang memangsa bakteri dan jamur, yang dianggap sebagai nematoda yang hidup bebas, mempunyai fungsi ekologi yang nyata. Sebagai contoh, nematoda yang hidup bebas berperan penting dalam siklus hara di dalam ekosistem tanah.

Nematoda parasit tanaman umumnya masuk ke dalam dua kelompok penting, yaitu: (1) kelompok yang tetap bergerak dan makan pada atau di dalam akar (nematoda bermigrasi), dan (2) kelompok yang menjadi menetap yang menyebabkan tanaman menghasilkan makanan dan struktur perlindungan (nematoda yang menetap). Jenis-jenis nematoda bermigrasi seringkali mempunyai bermacam-macam inang  kecuali beberapa marga, hanya menyebabkan dampak ekonomi bila kepadatan populasinya tinggi. Jenis-jenis yang menetap adalah parasit yang sangat khusus, yang memanipulasi tanaman inang pada tingkat molekul, dengan dampak nyata pada hasil, tetapi seringkali berpengaruh terhadap lebih sedikit macam inang daripada jenis-jenis migran.

Untuk mengidentifikasi nematoda parasit perlu mengekstraksi spesimen dari tanah atau contoh tanaman dan mengawetkan spesimen yang diperoleh.

1.3.1        Contoh tanah

Untuk keperluan diagnosis dan koleksi, tanah dikoleksi dari lapangan pada mintakat akar yang aktif dari tanaman yang dicurigai terinfeksi penyakit. Jika menyelidiki kerusakan tanaman terpencar-pencar pada bidang-bidang kecil, dianjurkan untuk mengambil contoh di dekat tepi bidang-bidang kecil itu, yang kerapatan populasi nematodanya mungkin tertinggi dan juga untuk mengambil contoh dari areal yang tidak terpengaruh untuk digunakan sebagai pembanding. Kedalaman pengambilan contoh dan jumlah sub-contoh dapat menjadi penting, namun di luar jangkauan bagian bab ini.

Sebaiknya mengambil contoh tanah yang lembab, karena beberapa nematoda yang dorman dalam tanah kering mudah rusak. Contoh tanah ditempatkan dalam kantong plastik dan harus dijaga agar tetap sejuk selama dalam pengangkutan dan harus diproses secepatnya. Beberapa nematoda,  tetapi tidak semua jenis, dapat disimpan di dalam lemari es sebelum diproses. Contoh yang mudah rusak dapat disaring dengan  saringan berukuran 10 mm untuk menghilangkan kotoran dan dicampur sampai rata, namun cara ini tidak selalu dapat digunakan untuk tanah yang ‘berat’.

Metode ekstraksi nematoda ada yang aktif, bertumpu pada gerakan nematoda, atau pasif, dengan memisahkan nematoda berdasarkan ukuran dan kerapatan. Metode paling sederhana untuk ekstraksi nematoda aktif ialah dengan menggunakan penampan Whitehead atau corong Baermann. Walaupun sederhana, ekstraksi berlangsung 2-4 hari dan perolehan nematoda yang gerakannya lamban atau yang berukuran besar kurang baik. Metode pasif melibatkan penyaringan, penuangan, dan pengapungan dalam berbagai kombinasi, dengan berbagai macam bias dan keefektifannya. Penyaringan basah dan sentrifugasi diferensial diuraikan dalam buku panduan ini. Kista dari jenis-jenis heteroderid juga dapat ditemukan dari tanah dengan cara penyaringan basah.

Ekstraksi penampan Whitehead

Contoh tanah disebarkan pada kertas tisu atau kain tenun halus pada saringan kasar yang ditaruh di atas bagian dasar penampan yang diberi air sampai tanah jenuh (Gambar 10). Setelah dibiarkan 1–4 hari, nematoda yang aktif akan bergerak ke bawah dan melalui tisu masuk ke dalam air. Volume tanah yang digunakan bergantung kepada ukuran penampan. Penampan yang besar (450 mm x 300 mm) dapat digunakan untuk menyebarkan 200 g tanah dalam lapisan yang tipis. Lapisan tanah yang tipis meningkatkan efisiensi ekstraksi dan mengurangi waktu ekstraksi.

Gambar 10     Penampan Whitehead untuk mengekstrak nematoda dari tanah dan tanaman

Sebelum mengumpulkan nematoda, saringan yang menyangga dipisahkan dengan hati-hati untuk mengurangi kontaminasi air dengan tanah. Selanjutnya, air dipindahkan ke dalam wadah yang sesuai (misalnya gelas ukur), sehingga nematoda akan tenggelam selama beberapa jam. Air sebaiknya dibuang dan hanya disisakan 5–20 ml, secara sangat hati-hati jangan sampai nematoda terbuang. Cara lain, nematoda dapat diperoleh dengan melewatkan air melalui saringan yang halus (ukuran 20–38 mm). Saringan yang lebih halus harganya mahal dan sulit diperoleh. Nematoda dapat hilang melalui saringan, tetapi kehilangan ini dapat diatasi dengan menangkap dan menyaring kembali filtrat beberapa kali.

Corong Baermann

Contoh tanah diletakkan di atas kertas tisu atau kain tenun halus pada saringan yang menopangnya dalam corong yang di lehernya dipasang tabung plastik dan penjepit. Kemudian alat ini diisi air untuk menjenuhkan tanah (Gambar 11). Walaupun hanya sedikit volume tanah yang dapat diproses, tetapi metode ini mempunyai keuntungan, yaitu nematoda akan terakumulasi di dalam tabung di atas penjepit dan siap diambil secara langsung dengan melepaskan sedikit air (5–10 ml) ke dalam botol kecil.

Gambar 11     Corong Baermann untuk mengekstrak nematoda dari tanah dan tanaman

Penyaringan basah dan sentrifugasi diferensial

Tanah disuspensikan dalam wadah bervolume 4 liter dengan air yang mengalir, namun harus dihindari jangan sampai meluap. Partikel tanah yang besar dibiarkan tenggelam selama 10 detik dan air dilewatkan melalui saringan berukuran 38 mm dan filtratnya ditampung dalam wadah kedua. Nematoda-nematoda yang tertangkap dicuci dari saringan dan dimasukkan ke tabung sentrifus dengan sedikit air. Karena beberapa nematoda dapat menembus saringan, filtrat disaring kembali untuk mendapatkan nematoda yang lepas, dan cara ini dapat diulangi sampai tiga kali. Proses keseluruhan, mulai dari pencucian tanah, dapat diulang dua kali atau lebih untuk memperbaiki hasil keseluruhan. Nematoda kemudian diturunkan dengan cara diputar dengan cepat dalam tabung sentrifus dan supernatan dibuang dengan hati-hati sampai airnya tinggal sedikit. Selanjutnya, nematoda disuspensikan dalam larutan gula pekat (450 g/l) dan disentrifus ulang. Bahan organik yang mengambang dibuang dari permukaan larutan gula, sedangkan larutan gula yang di dalamnya terdapat nematoda dicuci dalam saringan 38 mm dan nematodanya diambil. Filtrat dapat diselamatkan dan disaring lagi dua kali untuk memperoleh hasil yang maksimum.

Larutan gula pekat akan mengering dan merusak nematoda, jadi prosesnya harus dilakukan dengan singkat. Senyawa-senyawa lain dapat digunakan untuk membuat larutan dengan kerapatan yang sesuai, seperti NaCl, MgSO₄ atau silika koloid (Ludox, DuPont de Nemours).

Ekstraksi kista

Tanah kering angin disuspensikan dengan air mengalir dalam gelas piala berukuran 4 l dan diusahakan agar tidak sampai meluap. Tanah dibiarkan tenggelam selama 10 detik, dan air dilewatkan melalui saringan kasar berukuran 710 mm di atas saringan 250 mm. Tanah dicuci dan disaring dua kali lagi. Kemudian, material organik pada saringan halus diendapkan pada kertas saring di dalam corong Buchner dalam keadaan hampa udara, sebelum dilakukan pengamatan kista di bawah mikroskop binokuler. Jika digunakan corong tirus dan material organik disuspensikan dalam etanol 70%, kista akan diendapkan dalam suatu pita ke arah atas kertas saring.

1.3.2        Contoh tanaman

Nematoda ditemukan di dalam akar, batang, daun, dan biji tanaman, sehingga metode ekstraksi yang digunakan beragam, bergantung kepada tipe contoh dan jenis nematoda. Endoparasit migran paling baik diekstrak dengan alat pengkabutan, walaupun penampan Whitehead atau corong Baermann dapat digunakan. Nematoda penetap perlu diambil dengan cara memotong-motong jaringan yang terinfeksi atau diawetkan secara in situ.  Telur-telur beberapa nematoda penetap dapat diekstrak dengan cara mencuci dengan pemutih dan disaring, namun telur mempunyai nilai taksonomi terbatas, sehingga metode ini tidak dipertelakan di sini.

Nematoda penetap yang masih muda dan yang jantan dewasa yang bentuknya kecil dapat diekstraksi dengan cara pengkabutan. 

Ekstraksi dengan pengkabutan

Lemari kaca untuk pengkabutan berisi corong-corong tempat meletakkan jaringan tanaman (yang dipotong sepanjang 10 mm jika cocok) dalam sebuah keranjang yang berlubang-lubang dan diairi dengan cara pengkabutan selama kira-kira 10 detik setiap 10 menit (Gambar 12). Airnya ditampung di dalam tabung yang akan terisi air hingga meluap, tetapi laju aliran air cukup lambat, sehingga nematodanya mengendap di dasar tabung dan dikumpulkan setelah 2-4 hari. Volume air di dalam tabung dikurangi dengan menggunakan aspirator secara hati-hati. Pengkabutan menjaga agar air mengandung cukup banyak oksigen dan menghilangkan racun yang dihasilkan oleh jaringan  tanaman yang membusuk, sehingga nematoda tetap dalam keadaan baik. Penampan Whitehead dan corong Baermann dapat digunakan, tetapi memiliki lebih banyak keterbatasan untuk material tanaman daripada untuk tanah.

 

Gambar 12     Ekstraksi nematoda dari jaringan tanaman dengan cara pengkabutan

Pemotongan

Jaringan tanaman dapat dipisah-pisahkan di dalam cawan Petri berisi air dengan jarum atau skalpel yang berujung runcing di bawah mikroskop binokuler. Pencahayaan yang berupa kombinasi antara cahaya yang dipancarkan dan ‘incident illumination’ adalah yang terbaik. Nematoda yang dilepaskan dari jaringan biasanya siap untuk diamati dengan pencahayaan dari bawah dan miring atau tidak langsung. Membiarkan contoh untuk diam sesaat memungkinkan lebih banyak nematoda lepas dari jaringan yang dipotong. ‘Incident illumination’ mungkin menolong untuk tingkat pembengkakan nematoda penetap, seperti nematoda kista (Heterodera spp.), nematoda busuk akar (Meloidogyne spp.), dan nematoda nyali biji dan  daun (Anguina spp.).

Jaringan tanaman dapat dibersihkan dengan pemutih dan diwarnai dengan berbagai metode untuk mengamati nematoda in situ.  Walaupun cara ini cukup baik untuk keperluan diagnosis, namun tidak akan menghasilkan spesimen yang sesuai untuk dimasukkan ke dalam koleksi. 

1.3.3        Pengawetan dan perekatan

Mematikan dengan pemanasan

Sebelum spesimen nematoda difiksasi dengan bahan pengawet, adalah penting untuk mematikannya guna mempertahankan integritas struktur. Hal ini dilakukan dengan cara memberikan suhu kira-kira  60^oC, di dalam air atau fiksatif.  Air atau fiksatif panas dapat digunakan untuk menaikkan suhu sampai 60^oC, diikuti dengan pendinginan secara cepat dengan air atau fiksatif dingin. Jika penangas air tidak tersedia, untuk mempertahankan suhu air atau fiksatif pada 60^oC dapat dilakukan dengan menambahkan air mendidih dengan volume yang sama dengan air yang berisi nematoda agar mencapai suhu yang sesuai untuk membunuh nematoda dengan cara pemanasan. Cara lain, oven dengan suhu 55–60^oC dapat digunakan untuk memanaskan nematoda dalam air yang dangkal, dengan pengamatan berinterval 1 menit, hingga nematoda mati. Selama proses mematikan nematoda dengan cara pemanasan, adalah penting untuk tidak memberi panas yang berlebih atau merebus nematoda, karena hal ini akan mengganggu struktur dalamnya.

Fiksasi

Metode yang paling sederhana untuk mengfiksasi nematoda ialah dengan menambahkan formaldehid pekat agar kadar akhirnya menjadi 2-5% atau membunuh dengan cara pemanasan dengan larutan formaldehid panas yang konsentrasinya dua kali lipat. Spesimen sebaiknya dibiarkan di dalam fiksatif sekurang-kurangnya selama 12 jam, tetapi sebaiknya selama 2 minggu, sebelum dilakukan proses selanjutnya. Penyimpanan di dalam larutan formaldehid untuk jangka panjang juga diperbolehkan.

Fiksatif lain yang biasa digunakan adalah larutan TAF (formaldehid 3%, trietanolamin 0,2% dalam air suling) dan larutan FA4:1 (formaldehid 4%, asam asetat 0,1% dalam air suling), tetapi kedua larutan ini kurang baik untuk penyimpanan jangka panjang. Etanol tidak dapat digunakan sebagai fiksatif untuk mempelajari morfologi nematoda, tetapi digunakan untuk mengawetkan nematoda yang akan dianalisis DNA-nya.

Perekatan

Perekatan spesimen secara permanen dilakukan dengan cara memindahkannya ke dalam gliserol dengan metode evaporasi lamban. Mula-mula spesimen diletakkan dalam beberapa ml gliserol 2–5% dalam air suling di dalam cawan gelas yang dangkal. Air diuapkan dalam waktu seminggu di dalam oven yang bersuhu kira-kira  40^oC atau di dalam desikator. Cawan ditutup dengan tutup yang longgar untuk memperlambat laju penguapan.

Untuk memindahkan spesimen yang menarik ke kaca obyek, satu persatu nematoda perlu diambil di bawah mikroskop binokuler. Hal ini dilakukan dengan jarum halus, bulu yang diruncingkan, bulu mata yang ditempelkan pada jarum, atau sejenisnya. Nematoda dipisahkan setahap demi setahap ke permukaan dan diangkat melalui tegangan permukaan dengan gerakan tajam akhir dari jarum.  Perlakuan ini dilaksanakan dalam cawan yang dangkal namun diperlukan pengaturan ulang fokus mikroskop secara teratur. Praktek perlu dilakukan agar menjadi ahli dalam proses ini, tetapi keahlian ini dapat mudah dikuasai untuk memperoleh individu nematoda secara efisien.

Pindahkan beberapa sampai sepuluh nematoda yang mewakili berbagai tingkatan pada setetes gliserol tanpa air di atas kaca obyek yang bersih. Gunakan jarum untuk menaruh spesimen di tengah dan pastikan bahwa spesimen tidak mengambang. Untuk melindungi nematoda agar tidak lumat, beberapa potong serat gelas, kaca penutup yang pecah (No. 0), atau bilah lilin disusun di sekeliling spesimen. Kaca penutup, sebaiknya yang bundar, ditaruh di atas tetesan tadi untuk menghindari mengalirnya gliserol keluar dari kaca penutup. Jika digunakan bilah-bilah lilin atau lingkaran lilin (digunakan dalam bentuk cair yang dibiarkan membeku), kaca obyek perlu diletakkan di atas kompor listrik untuk mencairkan lilin. Selanjutnya kaca penutup di segel. Dahulu Glyceel digunakan secara rutin, namun sekarang tidak lagi dapat diperoleh, sebagai gantinya dapat digunakan misalnya dua bagian resin epoksi (misalnya 5 min. Araldite) atau DePeX (dari berbagai pemasok bahan kimia). Walaupun cat kuku digunakan, perekatan dengan cara ini tidak tahan lama di daerah yang beriklim hangat.

1.4       MEDIUM PERTUMBUHAN

Kebanyakan medium pertumbuhan dapat dibuat dari bahan dasar atau dapat diperoleh secara komersial. Sumber komersial mempunyai kualitas yang lebih konsisten daripada yang disiapkan dari bahan dasar.

Bakteri dihambat dengan cara menambahkan antibiotik pada agar-agar. Karena hampir semua antibiotik berubah sifatnya dengan pemanasan, biasanya antibiotik ditambahkan pada agar-agar cair yang steril (tepat di atas suhu pemadatan agar-agar).

Penisilin (50 unit per ml), streptomisin (50 unit per ml) dan tetrasiklin (30 unit per ml) dapat digunakan tersendiri atau dalam kombinasi. Khloramfenikol (50 mg per l) dapat diautoklaf dan ditambahkan pada saat persiapan.

Jumlah agar-agar yang ditambahkan ke media dalam resep berikut ini boleh jadi berbeda bergantung kepada merek agar-agar. Sebaiknya ditambahkan cukup banyak agar-agar untuk menghasilkan gelatin yang cukup kuat untuk digoreskan. Jika air leding diketahui mengandung kotoran beracun sebaiknya diganti dengan air suling.

Agar-agar Dekstrosa Kentang (Potato Dextrose Agar, PDA) adalah medium yang baik untuk pertumbuhan dan isolasi jamur. Bersihkan kentang tanpa dikupas. Potonglah  menjadi beberapa potongan dan rebus selama sekitar satu jam, kemudian saringlah kentang dan cairannya dengan saringan dan buanglah potongan-potongan yang kasar. Cara lain, kocoklah seluruh campuran dengan blender listrik.   Selanjutnya, ke dalam filtrat kentang tambahkan larutan agar-agar dan dektrosa, aduk, sambil menambahkan air leding hingga mencapai volume 1 liter. Kemudian, campuran diautoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.

Bahan-bahan untuk PDA
Kentang	200 g
Dekstrosa (glukosa)	20 g
Agar-agar	20 g
Air leding	1 liter

Resep ini dapat diubah dengan menggunakan sayuran dan biji-bijian lainnya. Setengah atau seperempat persentase PDA dapat dibuat dengan mengurangi jumlah kentang dan dekstrosa menurut perbandingan. 

Agar-agar air leding (Tap water agar, TWA) adalah medium yang baik untuk mengisolasi banyak jamur. Jerami gandum, biji serealia, atau material tanaman lainnya yang steril dapat ditempatkan ke media untuk merangsang sporulasi banyak jamur. Campurkan agar-agar dalam air dan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.

Bahan-bahan untuk TWA
Agar-agar	20 g
Air leding	1 liter

Agar-agar air sari V-8 (V-8 juice agar, V-8J) adalah medium yang baik untuk pertumbuhan jamur, terutama Phytophthora. Saringlah jus V-8 agar bebas dari kotoran. Campurlah semua bahan dan sterilisasikan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.   Bila air sari V-8 tidak dapat diperoleh, bahan ini dapat diganti dengan  campuran air sari tomat, wortel, dan seledri.

Bahan-bahan untuk V-8J
Air sari V-8, disaring	200 ml
CaCO3	3 g
Agar-agar	20 g
Air suling	800 ml

Agar-agar King’s B (King's B agar, KBA) adalah medium yang baik untuk isolasi secara umum bakteri patogen tanaman, terutama kelompok pseudomonad yang berpendarfluor (berfloresensi) dan jenis-jenis Erwinia. Sesuaikan keasaman (pH) medium menjadi 7,2 dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 25 menit.

Bahan-bahan untuk KBA
Pepton proteose	20 g
Gliserol	10 g
K2HPO4 (tanpa air)	1,5 g
MgSO4.7H2O	1,5 g
Agar-agar	15 g
Air suling	1 liter

Agar-agar gizi (Nutrient Agar, NA) adalah medium serbaguna yang baik untuk bakteri. Sesuaikan pH menjadi 7,4 dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

Bahan-bahan untuk NA
Ekstrak khamir	3 g
Pepton	5 g
NaCl	5 g
Agar-agar	15 g
Air suling	1 liter

Agar-agar pepton sukrosa (Sucrose Peptone Agar, SPA) adalah medium yang baik untuk pertumbuhan dan isolasi berbagai bakteri patogen tanaman. Sesuaikan pH medium menjadi 7,2-7,4 dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

Bahan-bahan untuk SPA
Sukrosa	20 g
Pepton	5 g
K2HPO4 (tanpa air)	0,5 g
MgSO4.7H2O	0,25 g
Agar-agar	12 g
Air suling	1 liter

Agar-agar ekstrak malt (Malt Extract Agar, MEA) adalah medium yang baik untuk pertumbuhan dan isolasi berbagai jamur dan khamir. Jumlah ekstrak malt yang digunakan dapat beragam. Campurlah bahan-bahan dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.

Bahan-bahan untuk MEA
Ekstrak malt	2 – 20 g
Agar-agar	20 g
Air suling	1 liter

Agar-agar gliserol (Glycerol Agar, GA) digunakan untuk mengawetkan kultur agar-agar kering sebagai spesimen herbarium. Autoklaf medium ini pada suhu 121°C selama 20 menit. Kultur agar-agar yang telah agak kering adalah kultur mengambang dengan sisi mengarah ke atas pada medium GA yang telah dituangkan ke dalam tutup  cawan Petri yang terbalik. Lempengan ini kemudian dikeringkan selama 2-3 hari. Lempengan GA yang kering lebih mudah dilipat dan elastis seperti karet dibandingkan dengan medium agar-agar kering lainnya.

Bahan-bahan untuk GA
Gliserol	25 ml
Agar-agar	20 g
Air leding	1 liter

2          PENGAWETAN DAN PENYIMPANAN SPESIMEN

2.1       SPESIMEN HERBARIUM

Spesimen herbarium adalah sebagian bahan tanaman dan/atau jamur kering di dalam paket yang berlabel. Spesimen itu dapat juga terdiri atas kultur kering, kaca obyek, potret dan gambar. Paket spesimen dapat juga memuat lembar kertas catatan singkat, korespondensi, dan catatan-catatan lain yang berkaitan dengan spesimen.

2.1.1        Spesimen kering

Bahan tanaman dan jamur dipres (ditekan) dan dikeringkan dengan cara meletakkannya di antara beberapa lembar kertas penghisap atau koran. Kertas penghisap atau koran yang memuat spesimen, kemudian diletakkan di antara dua lembar karton bergelombang. Papan kayu (atau bahan lain yang kaku) ditempatkan pada kedua sisi tumpukan, dan tali pengikat digunakan untuk menekan spesimen.  Tanaman-tanaman itu menjadi kering, sebaiknya tidak berkerut, dan spesimen yang bermutu tinggi dapat diperoleh dalam beberapa hari. Untuk mempercepat proses pengeringan, sumber panas atau udara buatan diperlukan, khususnya di daerah-daerah yang lembab seperti daerah tropik. Pada waktu pengeringan, kertas penghisap atau koran perlu diganti secara berkala.

Tanaman-tanaman seharusnya tetap dipres sampai benar-benar kering. Tanaman-tanaman yang sudah dipres dapat diletakkan di bawah sinar matahari, di dalam kamar ber-AC atau di dekat sumber panas untuk mempercepat pengeringan. Waktu yang diperlukan untuk pengeringan beragam, bergantung kepada tipe bahan tanaman dan kelembaban. Mengeluarkan tanaman-tanaman dari pres yang terlalu cepat akan mengakibatkan pengerutan atau pertumbuhan jamur pada permukaan spesimen. Pada umumnya, tanaman akan kering dalam waktu 5-10 hari. Sebelum ditempatkan di herbarium, spesimen-spesimen ini sebaiknya difumigasi atau ditaruh di dalam lemari es (freezer) untuk mencegah masuknya tungau dan serangga.

Cara termudah untuk mengawetkan spesimen anggota-anggota Agaricales yang besar dan Ascomycetes yang besar dan berdaging ialah dengan mengeringkannya secara cepat. Pengeringan akan mempengaruhi warna, bentuk dan ukuran, meskipun spesimen kering jauh lebih mudah dikelola dan dirawat daripada spesimen yang diawetkan di dalam cairan. Jamur-jamur besar dapat dikering-bekukan untuk mengawetkan warna dan bentuknya, tetapi sayangnya jamur-jamur itu mudah patah (rapuh) dan harus diperlakukan dengan hati-hati. Karena jamur-jamur besar seringkali tidak dapat dimasukkan ke dalam paket herbarium dan sangat mudah rusak, kotak karton kecil atau kantong plastik beritsleting dan silika gel yang mengindikasi sendiri diperlukan untuk penyimpanan jangka panjang.

Spesimen herbarium kering dan kultur kering sebaiknya disimpan di dalam paket kertas (kualitas arsip) atau karton bebas asam yang berukuran standar (kurang lebih 10-15 cm lebar x 10 cm tinggi). Spesimen-spesimen tersebut sebaiknya lebih dulu dimasukkan ke dalam paket kertas yang lebih  tipis dan bebas asam. Idealnya, semua lembar catatan singkat, label, lem, tinta, dan plastik yang digunakan di herbarium sebaiknya bebas asam, untuk mencegah kerusakan pada spesimen. Pena khusus untuk menguji pH dapat digunakan untuk mengetahui apakah suatu kertas bebas asam.

Setiap paket sebaiknya diberi label di bagian depan (Gambar 13) yang disertai dengan:

Ø  nomor tambahan herbarium;

Ø  nama ilmiah patogen;

Ø  substrat atau nama ilmiah inang tempat patogen ditemukan;

Ø  tempat koleksi dilakukan, termasuk negara, propinsi, garis lintang dan garis bujur;

Ø  nama kolektor dan nomor koleksi;

Ø  tanggal koleksi;

Ø  nama orang yang mengidentifikasi spesimen; dan

Ø  acuan kepada publikasi yang menyitir spesimen seperti itu.

Gambar 13     Contoh label paket yang digunakan di herbarium BRIP

Setiap spesimen di herbarium diberi nomor tambahan yang unik, yang membedakannya dari spesimen-spesimen lain dalam koleksi. Nomor yang unik ini terdapat pada label paket spesimen herbarium (Gambar 13). Kombinasi dari nomor tambahan dan kode lembaga dari Index Herbariorum memungkinkan suatu spesimen  dibedakan secara unik dari spesimen lain di dunia. Apabila suatu spesimen menghasilkan lebih dari satu takson, maka akhiran (a, b, c, dst.) diletakkan di belakang nomor tambahan, untuk mewakili setiap takson tertentu. Nomor tambahan yang sama digunakan di herbarium untuk bahan tanaman kering dan kultur yang berasal darinya.

Bilamana perlu, paket-paket duplikat dapat disiapkan dengan cara membagi spesimen menjadi beberapa paket. Setiap paket duplikat memuat informasi dan nomor tambahan herbarium yang sama dengan paket spesimen dari mana duplikat tersebut diambil. Paket-paket duplikat dapat disimpan atau dipertukarkan dengan spesimen-spesimen dari herbarium lain.

Sebagian besar spesimen herbarium dalam koleksi patologi tanaman adalah jamur. Pengaturan secara fisik spesimen-spesimen ini kebanyakan dilakukan dalam kelompok-kelompok di atas tingkat ordo dengan cara yang merefleksikan keturunan menurut evolusi (filogeni). Kebanyakan spesimen termasuk Ascomycotina atau Basidiomycotina dengan pengaturan lebih lanjut  dalam kelompok-kelompok ini menurut abjad  marga jamur. Beberapa kelompok patogen tanaman yang memiliki banyak anggota, sering disimpan secara terpisah, misalnya jamur karat (Uredinales), jamur api (Ustilaginomycetes) dan embun tepung (Erysiphales). Selanjutnya, pengaturan dalam setiap kelompok dilakukan menurut abjad marga inang (karena banyak jenis jamur karat, jamur api, atau embun tepung memiliki inang khusus).

Jamur-jamur anamorf (Deuteromycetes, Fungi Imperfecti, jamur aseksual, jamur berkonidia) paling baik disusun menurut nama-nama telemorf-nya, jika diketahui. Selanjutnya, beberapa jamur mungkin memiliki dua atau lebih nama anamorf (sinanamorf) yang termasuk dalam telemorf yang sama. Spesimen itu sebaiknya tetap disimpan menurut nama telemorfnya, bahkan apabila keadaan jamur seperti itu tidak terdapat pada spesimen. Dalam hal ini, tidak adanya tingkatan teleomorf sebaiknya dicatat pada label spesimen.

Spesimen-spesimen yang terlalu banyak untuk ditemukan menurut posisi filogenetiknya yang benar di herbarium, sebaiknya diacu-silang dengan kartu (atau paket herbarium kosong) yang secara jelas menunjukkan di mana spesimen yang sesungguhnya dapat ditemukan. Demikian pula halnya dengan spesimen-spesimen yang sedang dipinjam, sebaiknya diacu-silang dengan meletakkan kartu pada  posisi yang biasanya ditempati spesimen tersebut.

2.1.2        Spesimen tipe

Spesimen tipe adalah spesimen (atau gambar) tunggal yang mendasari nama ilmiah. Bila jamur baru dipertelakan dan diberi nama, maka spesimen herbarium harus ditunjuk sebagai acuan tetap untuk nama tersebut. Spesimen-spesimen tipe jamur harus diawetkan secara permanen dan dikeringkan. Kultur hidup tidak dapat ditunjuk sebagai spesimen tipe. Walaupun demikian, kultur jamur yang diawetkan dalam keadaan metabolismenya tidak aktif, dengan cara pengeringan-beku atau disimpan pada suhu yang sangat dingin, dapat digunakan sebagai spesimen tipe.

Menurut tradisi, bahan tipe ditempatkan dalam paket merah atau paket yang diberi batas atau tanda merah, agar mudah dikenal dalam koleksi herbarium. Beberapa contoh spesimen tipe adalah:

Ø  Holotipe - Satu-satunya spesimen atau gambar yang ditunjuk oleh penulis sebagai tipe untuk nama baru;

Ø  Isotipe - Spesimen yang merupakan duplikat holotipe;

Ø  Lektotipe - Spesimen atau gambar dari bahan asli yang ditunjuk sebagai tipe, jika pada waktu penerbitan tidak ada holotipe yang diusulkan, atau jika holotipe hilang, atau jika holotipe termasuk lebih dari satu takson;

Ø  Isolektotipe - Spesimen yang merupakan duplikat lektotipe;

Ø  Sintipe - Spesimen mana saja yang disebut di dalam penerbitan bila tidak ada holotipe yang ditunjuk, atau satu atau dua atau lebih spesimen yang mana saja, yang secara serempak ditunjuk sebagai tipe;

Ø  Paratipe - Spesimen yang disebut di dalam penerbitan, yang bukan holotipe, isotipe, atau salah satu sintipe;

Ø  Neotipe - Spesimen atau gambar yang dipilih untuk menjadi tipe tata nama, jika semua bahan yang mendasari nama takson hilang atau rusak;

Ø  Epitipe - Spesimen atau gambar yang dipilih untuk menjadi tipe tafsiran bila holotipe, lektotipe atau neotipe yang ditunjuk sebelumnya, atau semua bahan asli yang berhubungan dengan nama yang telah diterbitkan secara sah dapat dibuktikan berarti-dua dan tidak dapat diidentifikasi secara saksama untuk keperluan aplikasi nama takson secara tepat; dan

Ø  Topotipe - Spesimen yang dikumpulkan di lokasi yang sama dengan holotipe.

2.1.3        Kultur kering

Sifat-sifat morfologi kultur jamur sangat penting dalam studi mikologi. Kultur kering merupakan satu-satunya cara untuk membuat spesimen-spesimen isolat yang permanen dari tanah, air, atau binatang inang. Kultur jamur kering ekstra berguna untuk menambah bahan inang kering, jika sporulasi  jarang terjadi padanya. Kultur jamur dapat dikeringkan dan disimpan bersama dengan spesimen-spesimen dalam paket herbarium.

Kultur kering disiapkan dengan cara menumbuhkan jamur pada medium agar-agar yang sesuai di dalam cawan Petri hingga tingkatan yang diinginkan tercapai. Kultur itu kemudian dikeringkan di dalam cawan Petri hingga koloni lepas di dalam cawan. Kultur dalam cawan Petri dapat dikeringkan di ruang isolasi (laminar air flow) selama 2–3 hari.  Setelah pengeringan, kultur dapat dipindahkan dari cawan  Petri dan ditaruh dalam paket herbarium. Kultur dengan struktur jamur yang mudah rusak dapat disimpan di dalam cawan Petri yang tipis.

Kultur yang dikeringkan seperti tersebut di atas dapat melengkung, retak, dan tidak mungkin dipindahkan tanpa kerusakan. Hal ini dapat dihindari dengan cara memindahkan kultur yang  sebagian kering dari cawan dan mengapungkannya di atas agar-agar gliserol (Glycerol Agar, GA) panas (lihat Media Pertumbuhan, Bab 5) yang telah dituang ke dalam tutup cawan Petri. Tutup yang sama yang  telah menutup spesimen selama pertumbuhannya dapat digunakan, karena berisi bagian kecil-kecil kultur.  Kultur tersebut kemudian dibiarkan terbuka sampai benar-benar kering. Hasilnya adalah cakram yang kering dan lentur, yang dapat dilepaskan dan ditaruh dalam paket herbarium.

Pengeringan mungkin tidak akan mematikan jamur.  Mematikan kultur seringkali perlu dilakukan, karena beberapa jamur menghasilkan konidia di udara dalam jumlah besar yang dapat mengkontaminasi kultur-kultur lainnya di laboratorium. Menempatkan kultur-kultur ini di dalam desikator yang diberi formalin akan mematikan jamur. Cara lain, kultur dapat dimatikan dengan cara membalik cawan Petri yang mengandung kultur, menaruh kira-kira 1,5 ml formalin pada tutupnya, dan membiarkannya dalam kerudung uap selama  1–3 hari.

2.1.4        Kaca obyek (Gelas preparat)

Ujung-ujung kaca penutup yang ditempelkan pada asam laktat dapat ditutup rapat dengan dua hingga tiga lapis pernis kuku. Hal ini seharusnya dapat mencegah kaca obyek dari kekeringan selama beberapa tahun. Cara  lain, larutan alkohol polivinil (dalam bentuk serbuk) dalam asam laktat dapat digunakan sebagai perekat. Ini secara berangsur-angsur akan mengeras dan membentuk preparat (mount) yang permanen.

Prosedur dehidrasi dapat digunakan untuk menghasilkan preparat yang permanen. Serangkaian dehidrasi memerlukan pencelupan spesimen tanaman atau jamur ke dalam serangkaian larutan etanol yang semakin pekat (misalnya 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan etanol absolut), masing-masing selama beberapa menit hingga semua air hilang. Kemudian spesimen itu dapat dibersihkan di dalam xilen dan ditempel dalam media seperti balsam Kanada.

Idealnya, kaca obyek seharusnya tidak disimpan  dalam paket herbarium. Lebih baik kaca-kaca obyek ini disimpan di dalam laci khusus yang digunakan untuk kaca obyek. Masing-masing kaca obyek sebaiknya diacu-silang dengan nomor tambahan spesimen herbariumnya.

2.1.5        Pengepakan dan pengangkutan

Semua spesimen penyakit tanaman yang akan ditempatkan di herbarium sebaiknya disimpan di dalam  paket kertas atau karton bebas asam (Gambar 14). Spesimen-spesimen yang sangat besar, paling baik disimpan di dalam kotak-kotak kardus untuk menghindari kerusakan.  Setiap barang di dalam paket herbarium, misalnya lembar catatan koleksi, anotasi, gambar, dan kaca obyek sebaiknya diberi label yang jelas dengan nomor tambahan spesimen. Kultur kering sebaiknya ditaruh pada kertas saring dalam paket kertas tembus pandang dan disimpan bersama dengan bahan tanaman kering. Kaca-kaca obyek paling baik disimpan di dalam kotak kardus atau kotak plastik khusus untuk kaca obyek guna melindunginya agar tidak pecah.

 

Gambar 14     Paket-paket herbarium yang digunakan oleh Herbarium Ustilaginales Vánky (HUV) dan QDPI&F Plant Pathology Herbarium BRIP

Bila diangkut, spesimen-spesimen herbarium sebaiknya tetap berada di dalam paket-paket  kertas atau karton. Kemudian, paket-paket herbarium ini sebaiknya diikat menjadi satu, dibungkus dengan koran atau plastik bergelembung (bubble wrap) dan dimasukkan ke dalam kotak kardus yang lebih besar untuk melindunginya. Kultur hidup yang dikering-bekukan, baik yang disimpan di dalam ampul maupun botol kecil dari gelas, sebaiknya dibungkus dengan kapas dan diletakkan di dalam paket pengiriman dari kardus yang berbentuk silinder.

2.2       KULTUR

Tujuan utama dari penyimpanan kultur jamur atau bakteri ialah mempertahankannya dalam keadaan dapat hidup tanpa perubahan morfologi, fisiologi atau genetik untuk jangka waktu selama yang diperlukan. Kultur perlu dipertahankan untuk dapat hidup sekurang-kurangnya selama penelitian dan seringkali untuk jangka waktu tak terbatas, khususnya jika kultur itu berasal dari bahan tipe atau telah terdaftar di dalam suatu publikasi. Tanpa kultur yang telah diidentifikasi, terutama bakteri, tidaklah mungkin untuk melakukan taksonomi perbandingan guna mengklasifikasi dan memberi nama takson baru.

Konvensi Keanekaragaman Hayati (Convention of Biological Diversity), yang ditandatangani oleh 180 negara, mempengaruhi kultur jasad renik (mikrob) yang dikumpulkan sejak tahun 1995. Konvensi tersebut memberikan kewenangan kepada negara asal dan bertujuan untuk memberikan pembagian keuntungan yang pantas dan adil, khususnya bagi negara asal, apabila eksploitasi  ekonomi dari kultur tersebut membawa hasil. Tukar-menukar kultur antar koleksi seringkali memerlukan Persetujuan Serah-terima Bahan (Material Transfer Agreement, MTA). Implikasi MTA untuk koleksi kultur dan pelanggan belum jelas dan  banyak hal yang berkaitan dengan koleksi masih harus dikembangkan.

Tidak semua cara pengawetan berikut ini cocok untuk semua jenis jamur dan bakteri yang tumbuh pada medium kultur. Mencoba-coba seringkali diperlukan untuk mendapatkan cara penyimpanan jangka panjang yang terbaik.

2.2.1        Pertumbuhan pada agar-agar

Kultur biasanya ditanam di dalam botol McCartney 20 ml, dengan leher lebar untuk menjamin agar lebih banyak sub-kultur yang dapat dikelola. Medium yang cocok sebaiknya digunakan, misalnya setengah ukuran resep medium PDA untuk jamur, dan NA untuk bakteri. Beberapa jenis jamur dan bakteri memerlukan medium khusus. Medium tersebut dituangkan ke dalam botol hingga kira-kira setengahnya, kemudian disterilkan. Botol tersebut lalu didinginkan dengan cara dimiringkan pada satu sisinya sehingga agar-agar mengeras dan membentuk medium agar-agar miring.

Medium agar-agar miring diinokulasi dengan jamur atau bakteri dan diinkubasi. Sesudah inkubasi, kultur harus disimpan di tempat yang sejuk dan bebas debu. Lemari es atau ruang dingin bersuhu 5–8°C paling cocok untuk menyimpan kultur. Beberapa jamur dan bakteri peka terhadap suhu dingin, karena itu sebaiknya disimpan pada suhu 15°C. Kultur tersebut harus dimonitor secara teratur, karena medium agar-agar cepat mengering di lingkungan yang berkelembaban udara rendah. Jika menyimpan jamur, hendaknya berhati-hati terhadap serangan tungau. Semua botol kultur sebaiknya disegel dengan film plastik (parafilm) atau ditutup rapat sebelum inkubasi dan selama penyimpanan. Kultur perlu dipindahkan ke medium yang baru setiap enam bulan. Kewaspadaan perlu dilakukan untuk menghindari hilangnya isolat yang berharga, walaupun pemindahan yang berulang kali dapat mempercepat perubahan morfologi, hilangnya patogenisitas dan berkurangnya sporulasi.

2.2.2        Di dalam minyak mineral

Cara ini berguna terutama di daerah tropik, karena mencegah kultur cepat  mengering dan melindungi dari serangan tungau. Kultur ditumbuhkan seperti tersebut di atas, tetapi pada medium agar yang tidak terlalu miring. Hal yang penting adalah memastikan bahwa kultur itu tumbuh sehat, dan untuk jamur, yang menghasilkan banyak sekali spora.  Kultur ditutup dengan minyak mineral hingga kedalaman 1 cm di atas bagian atas kemiringan agar. Minyak mineral yang digunakan harus steril, yang dapat diperoleh dengan autoklaf  dua kali pada suhu 121°C selama 15 menit.

Minyak paling baik ditambahkan dengan dosis masing-masing untuk menghindari kontaminasi silang. Botol McCartney dengan tutup plastik dapat digunakan, tetapi mudah bocor jika terguling. Cara ini cukup sederhana,  dan tidak memerlukan alat atau bahan kimia yang mahal. Bergantung kepada jenisnya, daya tahan hidup kultur dapat berlangsung 2–40 tahun, walaupun idealnya, kultur diperbaharui setiap lima tahun.

2.2.3        Penyimpanan di dalam air

Potongan (balok) agar-agar diiris dari tepi kultur jamur yang masih baru (umur seminggu), kemudian di rendam di dalam air suling steril dalam botol kecil Wheaton 5 ml atau botol McCartney 20 ml. Tutupnya disekrup dan disegel dengan film atau dibungkus rapat. Botol kecil itu kemudian disimpan pada suhu ruangan. Dengan cara ini kultur dapat disimpan hingga beberapa tahun. Cara penyimpanan ini cocok terutama untuk jenis-jenis Pythium dan Phytophthora. Banyak bakteri juga dapat disimpan dengan cara ini. Ose inokulasi yang steril digunakan untuk memindahkan koloni-koloni bakteri berumur 24–48 jam ke dalam air suling steril.

2.2.4        Proses kering-beku

Proses kering-beku (freeze-drying) meliputi penghilangan air (pengeringan) dari kultur yang dibekukan dengan mengurangi tekanan secara bertahap melalui proses sublimasi. Sublimasi terjadi bila cairan yang beku berubah secara langsung menjadi gas tanpa melalui fase cair.

Kultur kering-beku disimpan di dalam ampul gelas atau gelas kecil yang disegel. Jamur-jamur penghasil spora yang berlimpah sangat sesuai untuk disimpan dengan proses kering-beku. Bakteri juga dapat disimpan baik dengan menggunakan cara ini. Daya hidup kultur dapat mencapai 10 tahun atau lebih. Alat untuk proses kering-beku relatif mahal untuk harganya dan perawatannya. Diperlukan petugas yang berpengalaman untuk mengoperasikan alat ini dan menyiapkan kultur untuk disimpan.  Salah satu keuntungan proses kering-beku adalah kultur kering-beku tidak perlu disimpan di dalam lemari es, cukup disimpan pada suhu kamar.

Setelah proses kering-beku, satu ampul dari setiap isolat sebaiknya dibuka dan ditumbuhkan untuk memeriksa daya hidup dan kemurniannya, karena tidak semua jenis dapat bertahan hidup dalam proses ini. Menumbuhkan kembali kebanyakan jamur yang kering-beku dapat dilakukan dengan cara menaruh sepotong kultur kering-beku ke dalam cawan medium agar-agar yang baru saja dituang. Bakteri dan khamir kering-beku memerlukan waktu, 30 menit biasanya cukup, untuk mencair kembali, baik di dalam air kaldu daging maupun air suling, sebelum digoreskan pada medium agar- agar.

2.2.5        Penyimpanan di dalam tanah

Tanah diayak dan ditempatkan dalam botol McCartney 20 ml, kira-kira setengah penuh, kemudian disterilkan dengan cara pemanasan kering atau diautoklaf dua kali pada suhu 121°C selama 15 menit. Suspensi spora di dalam air suling steril dituangkan ke tanah steril tersebut dan diinkubasikan pada suhu 20–25°C selama kira-kira 15–10 hari. Sebaiknya, kultur tersebut disimpan di dalam lemari pendingin. Kultur ini dapat bertahan hidup untuk jangka waktu lama. Menghidupkan lagi kultur dapat dilakukan dengan cara memindahkan secara aseptik sebagian tanah dari botol ke medium agar-agar yang sesuai. Cara ini dapat digunakan untuk menyimpan jenis-jenis Fusarium yang seringkali mengalami mutasi jika dipelihara pada medium agar untuk jangka waktu lama.

2.2.6        Penyimpanan di dalam silika gel

Suspensi sel bakteri atau spora dalam susu skim 5% (bobot/volume) dituangkan ke dalam botol berisi silika gel yang sudah disterilkan dan didinginkan. Gunakan silika gel murni yang tidak berwarna, berukuran 6–22 mesh, dalam botol kecil dengan tutup berdrat hingga setengah penuh, tutup dikendorkan, dan disterilkan di dalam oven. Silika gel di dalam botol dibiarkan mengering pada suhu kamar selama sekitar 14 hari hingga kristal-kristal silika terpisah. Selanjutnya, tutup botol diputar ke bawah hingga rapat dan botol disimpan di dalam lemari pendingin di atas silika gel indikator (berwarna) pada suhu 4–6°C. Apabila kultur diperlukan, beberapa  kristal silika diambil dari dalam botol dan disebarkan pada medium agar-agar yang cocok. Ketahanan hidup dapat berlangsung hingga 11 tahun bergantung kepada jenisnya. Cara ini sesuai untuk organisme yang dapat bertahan hidup pada pengeringan beku, dan mencakup bentuk-bentuk miselium yang menghasilkan sklerotium dan klamidospora.

2.2.7        Penyimpanan pada kertas saring

Kertas saring steril diletakkan di dalam cawan Petri, kemudian beberapa tetes air suling steril ditambahkan sekedar untuk membasahi kertas saring. Kemudian potongan kultur jamur pada medium agar-agar diletakkan di atas kertas saring dan cawan Petri disimpan di dalam inkubator bersuhu 25°C, hingga jamur tumbuh di seluruh  kertas saring. Setelah kertas saring benar-benar menjadi kering, dalam waktu 2–4 minggu, kertas saring itu dipotong secara aseptik menjadi potongan-potongan kecil dan dimasukkan ke dalam botol-botol kecil yang steril dan kedap udara, selanjutnya disimpan pada suhu 4°C. Untuk menghidupkan lagi kultur, ambil 1 atau 2 potong kertas saring dari botol dan pindahkan secara aseptik ke medium PDA. Pertumbuhan hifa dari potongan-potongan kertas saring biasanya jelas kelihatan dalam waktu 2 hingga 4 hari. Cara penyimpanan ini seringkali digunakan untuk jenis-jenis Fusarium.

2.2.8        Kriopreservasi

Penyimpanan mikroorganisme di dalam lemari es bersuhu sekitar -20°C hingga  -85°C (kriopreservasi/cryopreservation) adalah cara pengawetan yang baik untuk kebanyakan jamur, bakteri, dan virus. Salah satu sistem penyimpanan yang paling sederhana dan paling populer untuk jamur dan bakteri melibatkan penggunaan manik-manik keramik berpori (cryobeads) yang disuspensikan di dalam cairan kriopreservasi, misalnya gliserol, dalam botol kecil dari plastik. Setelah diinokulasi dengan kultur, larutan yang berlebih sebaiknya diambil dengan menggunakan pipet steril dan botol kecil itu disimpan di dalam lemari es. Menghidupkan lagi kultur dilakukan dengan cara mengeluarkan satu manik-manik (dari dalam botol) dan menginokulasikannya  ke dalam medium cair, atau menggoreskannya pada medium agar-agar yang sesuai.

2.2.9        Nitrogen cair

Penyimpanan mikroorganisme pada suhu yang sangat rendah, -190°C hingga -196°C, di dalam tabung berisi nitrogen cair (juga merupakan suatu kriopreservasi) adalah cara pengawetan yang terbaik untuk kebanyakan jamur dan bakteri. Kultur, jaringan tanaman atau suspensi spora, diberi perlakuan dengan krioprotektan (cryoprotectant), misalnya gliserol 10%. Untuk bakteri, mula-mula kultur bakteri disuspensikan dalam medium nutrien ekstrak daging, kemudian dipindahkan secara aseptik ke dalam ampul steril dan dibekukan hingga suhu yang sangat rendah di dalam uap nitrogen cair. Laju pendinginan sangat kritis, dan menghidupkan lagi yang terbaik dapat dicapai jika dilakukan secara perlahan-lahan. Pada suhu yang sangat rendah, metabolisme ditekan. Apabila organisme dapat bertahan hidup pada pembekuan awal, maka seharusnya ia mampu hidup untuk jangka waktu tak terbatas. Teknik ini membutuhkan peralatan yang mahal serta sumber nitrogen cair yang dapat diandalkan. Petugas yang berpengalaman diperlukan untuk menjamin kualitas penyimpanan yang optimum.