Pengelolaan Koleksi Patogen Tanaman (bag II)

1          MEMBANGUN KOLEKSI

1.1       MEMPERBANYAK JUMLAH KOLEKSI

Sumber utama spesimen-spesimen di dalam koleksi patologi tanaman adalah dari para ilmuwan kesehatan tanaman profesional yang bekerja di laboratorium diagnostik, yang biasanya bertempat di departemen-departemen pemerintah, pusat-pusat penelitian, atau universitas. Spesimen-spesimen yang dikumpulkan dari lapangan, terutama selama survei, biasanya dikirim ke laboratorium diagnostik untuk menentukan apakah spesimen akan disimpan atau tidak. Spesimen-spesimen yang mewakili catatan baru tentang patogen, tanaman inang, atau lokasi, sebaiknya disimpan di herbarium yang telah dikenal. Beberapa herbarium memiliki staf yang bertugas mendiagnosis dan kebanyakan memiliki pakar yang akan menentukan identitas kelompok-kelompok patogen tertentu.

Spesimen-spesimen seringkali berasal dari staf dan mahasiswa universitas dan pusat-pusat penelitian. Hal ini terutama karena semua karya  yang dipublikasikan seharusnya mencantumkan  nama herbarium tempat spesimen-spesimen disimpan. Spesimen-spesimen ini memberikan jalan yang dapat dipercaya untuk memeriksa atau membetulkan identitas patogen yang dicatat dalam survei dan penelitian (ekologi, epidemiologi, filogenetika, morfologi, dan molekuler).

Lebih lanjut spesimen-spesimen dapat bertambah ketika duplikat dan eksikata (seperangkat spesimen kering berlabel) dipertukarkan antar herbarium. Hadiah, pinjaman, dan pembelian merupakan cara lain untuk menambah koleksi spesimen. Pinjaman permanen, yaitu bila seluruh spesimen dipinjamkan untuk waktu tidak terbatas dari satu lembaga kepada lembaga lain, merupakan cara yang bermanfaat untuk melindungi koleksi berharga, baik yang tidak dapat diakses maupun yang tidak dapat disimpan dan diurus secara memadai.

1.2       PENGUMPULAN SPESIMEN DARI LAPANGAN

Kebanyakan spesimen dalam koleksi patogen tanaman berasal dari lapangan, baik dari lingkungan pertanian maupun dari alam bebas. Spesimen tanaman berpenyakit dapat dikenal dari gejala-gejala dan tanda-tanda yang khusus. Gejala adalah perubahan penampilan tanaman atau bagian-bagiannya yang dapat dilihat, yang muncul karena suatu penyakit (Tabel 1). Gejala dapat merupakan akibat dari gangguan terhadap kemampuan tanaman untuk melakukan fotosintesis secara efisien, berkembang-biak, menyerap air, atau mengangkut zat-zat hara.

Gejala	Uraian
antraknos (anthracnose)	jejas  hitam, nekrosis, disebabkan oleh Colletrotrichum
embun hitam (black mildew)	koloni jamur parasit (Meliolales) yang hitam dan rapat, biasanya di permukaan daun tanaman tropik
hawar (blight)	kematian jaringan tanaman yang terjadi secara cepat dan menyebar luas
kanker (canker)	jejas nekrosis cekung yang sering terdapat pada batang berkayu, cabang, atau akar
rebah semai (damping-off)	kerebahan dan pembusukan semai dekat permukaan tanah sebelum muncul atau segera setelah muncul di atas tanah, disebabkan oleh jamur seperti Pythium dan Rhizoctonia
mati pucuk (dieback)	kerontokan daun sebagian, kematian ranting dan cabang, dan bahkan kematian seluruh bagian tanaman
bulai, embun berbulu (downy mildew)	‘bloom’ keputih-putihan pada daun dan batang yang disebabkan oleh koloni sporangiosfor dan sporangia anggota Peronosporales
enasi (enation)	pertumbuhan abnormal dan kecil dari jaringan inang, sering berupa perluasan mendatar dari pembuluh-pembuluh, terutama pada daun dan bunga
fasiasi (fasciation)	pertumbuhan berlebihan (proliferasi) pada tunas yang tampak sebagai berkas-berkas tipis dan mendatar dari tunas yang melengkung atau keriting
puru, nyali (gall)	pembengkakan yang abnormal atau tumor
gumosis (gummosis)	keluarnya getah dari jaringan inang
lesio, belur (lesion)	areal tertentu dan terbatas dari jaringan yang sakit
mosaik (mosaic)	variasi tak sempurna dari warna hijau muda dan hijau tua pada daun, yang merupakan gejala dari banyak penyakit virus
filodium (phyllody)	bunga yang berubah bentuk menjadi struktur seperti daun
embun tepung (powdery mildew)	‘bloom’ seperti tepung berwarna putih di permukaan tanaman, terdiri atas miselium jamur, konidiofor dan konidia jamur embun tepung (Erysiphales)
bisul, pustul (pustule)	lepuh di tempat munculnya jamur
buncak akar (root knot)	pembengkakan atau puru (nyali) pada akar yang disebabkan oleh nematoda tertentu
busuk (rot)	pelunakan dan disintegrasi jaringan tanaman oleh enzim yang dihasilkan patogen (dapat keras, lunak, kering, basah, hitam, putih, dsb.)
karat (rust)	bisul yang dibentuk oleh jamur karat (Uredinales)
kudis (scab)	areal sakit yang kasar, dangkal, menyerupai kerak
lepuh (scald)	jaringan yang tampak seakan-akan terbakar oleh air panas
lubang gotri (shot hole)	penyakit daun dengan jaringan mati yang luruh dan meninggalkan lubang bundar
jamur api (smut)	massa spora hitam pada daun, batang dan bunga, disebabkan oleh jamur api (Ustilaginomycetes)
jamur jelaga (sooty mold)	lapisan koloni saprobik yang rapat dari jamur yang berwarna gelap dan dangkal (seringkali Capnodiales) yang hidup pada kotoran serangga (seringkali  afid atau kutu) pada permukaan daun dan cabang
menghijau (virescence)	munculnya warna hijau di bagian-bagian tanaman yang biasanya tidak berwarna hijau, terutama pada bunga
layu (wilt)	hilangnya pembengkakan dan terkulainya bagian-bagian tanaman
sapu setan (witches’ broom)	proliferasi (pertumbuhan yang tidak teratur dan berlebihan) pada kuncup dan tunas yang muncul pada atau dekat tempat yang sama

Tabel 1           Beberapa gejala umum dan pertelaan penyakit tanaman

Tanda adanya penyakit adalah kehadiran patogen yang dapat dilihat, misalnya tubuh buah atau kotoran yang berkaitan dengan penyakit. Beberapa tanda umum penyakit adalah:

·         Askomata, aservuli, konidiofor, piknidia, struktur tubuh buah jamur kecil yang menghasilkan konidia

·         Basidiokarp, tubuh buah Polyporales atau Agaricales

·         Miselium, massa hifa jamur (benang-benang jamur)

·         Ooze, cairan lengket yang keluar dari luka atau lubang

·         Rizomorf, untaian hifa jamur seperti tali (seringkali berwarna tua).

1.3       PENANGANAN SPESIMEN

Pemilihan spesimen, baik untuk mendiagnosis penyakit tanaman maupun sebagai sumber taksonomi, memerlukan kehati-hatian. Contoh-contoh tanaman terbaik untuk dikumpulkan adalah yang berada pada tingkat awal hingga pertengahan perkembangan penyakit, ketika patogen masih aktif. Contoh-contoh tanaman berpenyakit parah seringkali tidak dapat digunakan, karena patogennya mungkin sudah tidak dapat hidup dan organisme saprob mungkin sudah mengkolonisasi jaringan-jaringan nekrotik, sehingga isolasi patogen sulit dilakukan. Pemilihan material juga penting. Pengetahuan dasar tentang gejala dan cara terbentuknya diperlukan untuk menjamin bahwa bagian tanaman yang dikumpulkan terinfeksi patogen. Pada beberapa kasus, gejala-gejala penyakit dapat muncul di satu bagian tanaman, tetapi patogennya ditemukan di tempat lain, misalnya, penyakit layu yang gejalanya muncul pada daun, meskipun patogennya terdapat di dalam sistem pembuluh pada akar dan batang. Daftar perlengkapan yang berguna untuk perjalanan koleksi dapat dilihat pada Gambar 5.

Perlengkapan
Gunting Stek	Pengepres tanaman	Koran	Label
Lensa tangan	Sekop	Kantong kertas	Kantong plastik
Gunting	Tinta penanda	Amplop	Pensil
GPS	Gergaji tangan	Parang	Peti es
Peta	Pustaka

Gambar 5       Perlengkapan yang biasa digunakan untuk koleksi spesimen penyakit tanaman

Beberapa asas penting pada waktu mengumpulkan dan menangani spesimen penyakit tanaman adalah:

·         Tentukan identitas tanaman inang. Apabila identitas tanaman inang tidak jelas maka material tanaman yang sehat, terutama sekali bunga dan buah, sebaiknya dikumpulkan. Anda seharusnya jakin bahwa material sehat yang dipilih untuk identifikasi inang adalah benar-benar tanaman inang. Hal ini khususnya penting sewaktu mengumpulkan jamur api dan penyakit lainnya yang merusak perbungaan rumput-rumputan yang seringkali tumbuh dalam populasi campuran.

·         Gunakan kantong kertas untuk spesimen. Jangan membungkus material tanaman herba segar dengan plastik, karena akan menyebabkan contoh tanaman berembun yang mendorong jasad saprob cepat menduduki dan membusukkan jaringan tanaman. Kantong plastik sebaiknya hanya digunakan untuk penyimpanan jangka pendek spesimen yang lembab.

·         Contoh-contoh tanaman perlu dipak untuk menghindari terjadinya kerusakan oleh peremasan dan kondensasi. Kelembaban permukaan akan mendorong pertumbuhan saprob dan menyebabkan contoh tanaman tidak berguna.

·         Tulislah label dengan pensil; tinta tidak cocok, karena luntur jika lembab.

·         Dapatkan izin-izin yang diperlukan untuk koleksi dan pemindahan spesimen. Di beberapa daerah koleksi spesimen biologi mungkin dilarang, misalnya di taman-taman nasional dan lahan pribadi. Perpindahan spesimen antar negara memerlukan izin-izin impor dan ekspor serta izin karantina.

1.3.1        Daun, batang dan buah

Daun-daun sebaiknya dikumpulkan ketika permukaannya kering, tetapi jika hal ini tidak mungkin, keringkan daun-daun itu dengan cara menghisap menggunakan kertas koran sebelum meletakkannya di antara tumpukan koran baru atau kertas penghisap lain. (Jangan menggunakan kertas tisu, karena hancur jika basah dan sulit dibersihkan dari contoh tanaman). Pres dan keringkan material daun, pastikan untuk membentangkan daun-daun agar tidak tumpang tindih. Apabila daunnya tebal atau  berdaging sekali, kertas koran perlu diganti setiap hari hingga daun menjadi kering.

Potongan-potongan batang yang dikumpulkan sebaiknya memiliki areal jaringan yang sehat dan yang sakit. Selanjutnya, secara hati-hati, bungkuslah contoh-contoh tanaman tersebut satu per satu dengan kertas koran, karena jika dipak bersama-sama mudah rusak.

Sewaktu mengumpulkan spesimen berdaging seperti buah, pilihlah contoh yang tingkat perkembangan gejala penyakitnya masih dini hingga tingkat pertengahan. Pembusukan sekunder dan saprob seringkali menguasai buah pada tingkat  perkembangan gejala yang lanjut, sehingga sulit untuk mendiagnosis patogen penyebabnya. Bungkuslah spesimen buah secara terpisah dengan kertas koran yang kering dan jangan membungkusnya dengan plastik.

Jamur karat dan jamur api

Ketika mengumpulkan jamur karat, periksalah kedua sisi daun untuk menemukan teliospora yang berwarna hitam-coklat dan urediniospora yang kuning-jingga. Jamur api sering merusak perbungaan  atau bagian-bagian perbungaan, rerumputan dan ‘sedges’. Determinasi tanaman inang secara hati-hati perlu sekali agar identifikasi jamur api dapat dilakukan dengan tepat, namun hal ini sulit dilakukan jika perbungaan telah rusak. Lipatlah contoh tanaman yang sakit dengan kertas koran, sehingga spora jamur karat dan jamur api ada di dalamnya.

Penyakit-penyakit bakteri

Contoh tanaman yang diduga berpenyakit bakteri lebih sulit dikumpulkan dan dikirim ke laboratorium yang jauh, karena kehancuran jaringan seringkali terjadi secara cepat. Taruhlah contoh di dalam kantong kertas dan bungkuslah dengan kertas koran yang dibasahi agar tidak menjadi kering. Jika mungkin, taruhlah contoh di tempat yang sejuk dan jauh dari sinar matahari. Spesimen-spesimen bercak daun dan hawar yang dipres dan dikeringkan sebaiknya disimpan untuk digunakan sebagai material herbarium dan juga sebagai sumber acuan. Banyak bakteri patogen yang dapat bertahan hidup selama berbulan-bulan, atau bahkan bertahun-tahun di dalam material kering yang disimpan pada suhu kamar.

Penyakit-penyakit virus

Material tanaman yang diduga terinfeksi virus dapat dikumpulkan dan diawetkan untuk sementara dengan menggunakan desikator kecil (Gambar 6). Desikator tersebut dibuat dengan cara mengisi tabung plastik dengan kristal-kristal kalsium klorida (CaCl₂) atau silika gel hingga sepertiga isinya. Spesimen sebaiknya dipisahkan dengan kapas dari bahan pengering tersebut. Teknik ini paling baik dilakukan pada suhu 0–4°C, tetapi juga cukup baik pada suhu kamar.

Gunting atau pisau skalpel yang aman digunakan untuk mengiris jaringan daun. Jika daun berdebu, tertutup jamur jelaga atau serangga sisik (kutu kebul) dapat dibersihkan dengan cara menyekanya, menggunakan air atau alkohol. Irisan-irisan daun sebaiknya diambil dari bagian tengah helai daun. Irislah daun menjadi potongan-potongan berukuran 3 mm x 5 mm dan taruhlah 5–10 lembar di dalam setiap desikator. Setiap akan memotong contoh tanaman, gunting dan pisau pengaman yang digunakan perlu disterilkan dengan alkohol atau larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 10% untuk menghindari kontaminasi silang.

Cara lain, spesimen-spesimen yang diduga terinfeksi virus dapat ditempatkan di dalam kantong plastik bersama-sama dengan beberapa kertas yang dibasahi dan ditaruh di dalam peti es untuk diangkut ke laboratorium diagnostik spesialis. Kondisi ini memungkinkan material tanaman tetap segar.

 

Gambar 6       Desikator untuk menyimpan contoh daun yang terinfeksi virus

1.3.2        Akar dan tanah

Jaringan akar yang sakit atau struktur patogen yang berasosiasi dengan perakaran seringkali sangat mudah rusak. Jangan mencabut tanaman dari tanah, karena dengan cara ini jaringan yang sakit atau patogen akan terpotong, sehingga diagnosis menjadi lebih sulit.

Kurangilah tanah yang berlebihan atau, jika mungkin, cucilah akar-akar dengan hati-hati, kecuali jika contoh tersebut akan diperiksa keberadaan nematodanya. Tanah mengandung banyak mikroorganisme yang siap mengkolonisasi jaringan yang mati atau hampir mati. Saprob-saprob ini dapat mengganggu upaya untuk memperoleh patogen dari jaringan yang sakit. Ketika melepaskan tanah dari perakaran, jangan menggosok perakaran tersebut, karena hal ini dapat menyebabkan hilangnya jaringan akar yang mungkin penting dalam diagnosis penyakit. Bungkuslah perakaran dengan kertas koran untuk dibawa ke laboratorium.

Contoh tanah yang cukup banyak perlu diambil untuk memberi gambaran yang tepat mengenai situasi penyakit. Kendala utama dalam pengumpulan contoh tanah yang banyak ialah bobot dan volume tanah yang diambil. Waktu dan ruangan yang diperlukan untuk pemrosesan contoh juga harus dipertimbangkan.

Patogen-patogen bawaan tanah biasanya tidak tersebar secara merata di dalam tanah; mereka cenderung membentuk kelompok-kelompok atau kumpulan, baik pada kondisi yang paling sesuai maupun di sekitar tempat infeksi. Strategi yang terbaik ialah mengumpulkan sejumlah contoh secara acak dengan memperhitungkan sebaran patogen yang tidak merata. Pada dasarnya, semakin banyak contoh tanah yang diambil semakin akurat keseluruhan penilaian penyakit.

Jumlah contoh yang dikumpulkan beragam, bergantung kepada kondisi saat itu, tetapi umumnya sejumlah contoh individual perlu diambil, kemudian dicampur menjadi satu, menjadi contoh yang sebenarnya. Material gabungan beberapa contoh tersebut dicampur rata, kemudian diambil bagian contoh yang lebih kecil. Jika mengambil contoh untuk nematoda, penanganan tanah harus dilakukan secara hati-hati agar tidak menimbulkan kerusakan fisik pada nematodanya karena goresan.

Pengambilan contoh tanah yang sangat basah atau sangat kering sebaiknya dihindari. Contoh tanah sebaiknya diambil dari kedalaman minimal 5–10 cm di bawah permukaan, karena di sini, di zona akar, patogen-patogen tanaman cenderung paling banyak dijumpai. Jika pertanaman memperlihatkan bidang-bidang yang pertumbuhannya tidak baik, contoh tanah yang diambil dari tempat yang paling terpengaruh dipisahkan dari contoh tanah dari daerah yang sehat, sehingga dapat dibuat perbandingan. Masing-masing contoh tanah sebaiknya memiliki bobot sekitar 250–300 g.

Jika semuanya memungkinkan, sebaiknya perakaran dimasukkan ke dalam contoh atau dibawa secara terpisah. Untuk tanaman herba, kira-kira 25–100 g contoh jaringan akar cukup memadai (bobot yang lebih rendah sesuai untuk sayuran, sedangkan bobot yang lebih tinggi lebih cocok untuk tanaman dengan perakaran besar, seperti pisang). Untuk tanaman berkayu mungkin perlu menggali hingga kedalaman 30 cm dekat pangkal pohon atau sampai ditemukan perakaran yang menunjukkan batas antara jaringan sehat dan yang sakit.

Contoh-contoh tanah sebaiknya ditaruh di dalam kantong plastik yang kuat dan diberi label kertas dengan tulisan pensil atau label plastik yang ditempatkan di dalam kantong. Contoh-contoh tersebut sebaiknya ditaruh di tempat yang sejuk, tidak ditaruh di bawah terik matahari atau di kendaraan terkunci yang diparkir di bawah sinar matahari. Contoh-contoh seharusnya diperlakukan dengan hati-hati dan segera diproses atau dikirim untuk dianalisis. Jika pengiriman atau pemrosesan dengan segera tidak memungkinkan, contoh-contoh dapat disimpan di dalam lemari es dengan suhu 4–8^oC selama beberapa hari tanpa mengalami kemunduran.

1.3.3        Jamur besar

Jamur-jamur berdaging, terutama sebagian besar anggota Agaricales, paling mudah ditemukan, tetapi seringkali paling sulit untuk dibawa ke laboratorium. Beberapa spesimen yang sehat dari berbagai tingkat perkembangan sebaiknya dikumpulkan. Jangan mengambil jamur besar dengan cara mencabutnya dan usahakan agar batangnya tidak patah. Galilah jamur-jamur itu sedemikian rupa sehingga tidak merusak bagian pangkalnya. Jamur-jamur itu sebaiknya dibungkus satu per satu dengan kertas koran dan ditaruh dengan hati-hati di dalam wadah agar tidak terpencet.

Spesimen-spesimen jamur besar perlu segera dikeringkan. Bergantung kepada situasi, hal ini dapat dilakukan dengan beberapa cara:

Ø  di dalam oven dengan ventilasi-kipas (45°C, semalam);

Ø  dengan pengering buah listrik; dan

Ø  menggunakan sumber panas, misalnya api kemah, pemanas gas, lampu minyak, atau di bawah sinar matahari.

Cetakan-cetakan spora, terutama sekali warnanya, merupakan pertolongan penting untuk mengidentifikasi jamur-jamur besar yang memiliki bilah. Cetakan spora dibuat dengan memotong pileus (tudung) dan menempatkannya (dengan bilah ke arah bawah) di atas kertas karton putih selama 15 menit hingga beberapa jam. Wadah perlu digunakan untuk menutupi material itu guna melindunginya agar aliran udara tidak mengganggu cetakan. Mungkin sulit untuk melihat cetakan spora jamur berspora putih, dan sebaiknya digunakan kertas karton hitam. Warna spora mudah dilihat dari cetakan spora dan ini juga memberikan kesan yang jelas tentang pola bilah.

1.4       PELABELAN SPESIMEN

Spesimen yang diberi label tidak sebagaimana mestinya sebenarnya tidak ada gunanya, bagaimanapun baiknya contoh tersebut. Rincian informasi koleksi yang seharusnya menyertai spesimen termasuk :

Ø  Nama tanaman inang dan bagian tanaman yang terserang;

Ø  Letak tempat yang sebenarnya, kota, negara bagian/propinsi/kabupaten, negara (garis bujur/garis lintang, dan ketinggian tempat, jika diketahui). Alat Sistem Posisi Global (Global Positioning System, GPS) adalah cara terbaik untuk memperoleh koordinat yang tepat. GPS mengikuti jalan satelit yang mengorbit bumi. Dengan menggunakan tiga satelit, GPS dapat menghitung garis bujur dan garis lintang dengan benar. Dengan menggunakan empat satelit, GPS dapat menentukan ketinggian tempat. Koordinat-koordinat yang ditentukan oleh GPS memungkinkan dikembangkannya peta sebaran yang akurat untuk patogen tanaman;

Ø  Tanggal koleksi;

Ø  Nama kolektor (nomor koleksi, jika diberikan); dan

Ø  Gejala penyakit dan keparahannya (misalnya, jumlah tanaman yang terserang).

Semua spesimen yang diserahkan kepada suatu herbarium harus diberi label sebagaimana mestinya (Gambar 7). Nama orang yang menyerahkan spesimen dan rincian kontaknya adalah penting. Alasan untuk menyerahkan contoh itu juga harus  dinyatakan dengan jelas, misalnya untuk diagnosis atau untuk disimpan.

Gambar 7       Contoh catatan koleksi lapangan yang digunakan di herbarium BRIP

1.5       SURVEI DAN PENGAMBILAN CONTOH

Survei digunakan untuk menentukan jenis dan beratnya penyakit tanaman yang mempengaruhi tanaman inang. Survei penyakit tanaman diperlukan untuk:

Ø  Menentukan sebaran dan status hama penyakit di suatu daerah. Hal ini mungkin untuk persyaratan daerah bebas yang memberi kemudahan ekspor dan akses pasar dengan cara menentukan ada tidaknya penyakit-penyakit tertentu yang penting dari sudut karantina;

Ø  Memprioritaskan masalah-masalah penyakit dan memberi  pedoman untuk pengelolaan hama penyakit agar pengalokasian sumber-sumber perlindungan tanaman dapat dilakukan;

Ø  Menemukan penyakit-penyakit asing dan yang baru muncul;

Ø  Menilai kerugian tanaman dan menentukan tingkat kesehatan tanaman;

Ø  Memahami dinamika hama penyakit;

Ø  Mengidentifikasi inang pilihan;

Ø  Menilai kemanjuran tindakan-tindakan pengendalian;

Ø  Menentukan kelaziman (prevalensi) hama tanaman dan menghubungkannya dengan kerusakan tanaman; serta

Ø  Mengidentifikasi musuh-musuh alami.

Survei dapat bersifat kualitatif atau kuantitatif. Survei kualitatif menentukan apakah penyakit tanaman tertentu ada atau tidak ada. Survei kuantitatif menentukan banyaknya penyakit tanaman tertentu, khususnya dalam kaitannya dengan jumlah kerusakan yang disebabkannya pada tanaman inang.

Survei tersebut harus meliputi tempat-tempat yang mewakili suatu kawasan dan mencakup wilayah yang cukup luas untuk memperoleh tingkat keakuratan yang dikehendaki. Maksud dan tujuan survei akan menentukan perlengkapan, teknik dan keterampilan yang diperlukan untuk melakukan survei. Jumlah informasi yang akan dikumpulkan dan tingkat keakuratan akan menentukan skala survei.

Tatacara pengambilan contoh sebaiknya sederhana, mewakili dan dapat dipercaya. Taksiran kasar mengenai ukuran contoh dapat diperoleh dari survei percobaan yang menaksir intensitas penyakit untuk sejumlah ukuran contoh yang berlainan. Dengan membandingkan hasil-hasil ini dimungkinkan untuk memilih ukuran contoh terkecil yang diperlukan untuk memperoleh taksiran yang dapat dipercaya mengenai intensitas penyakit.

Merupakan hal yang penting bahwa pola pengambilan contoh yang mana saja memperhitungkan sebaran penyakit. Tanaman-tanaman yang sakit mungkin dapat memiliki sebaran secara acak, teratur atau mengelompok. Pengambilan contoh secara acak seringkali memberikan hasil yang baik, karena banyak penyakit tanaman memiliki sebaran yang mengelompok. Kadang-kadang diperlukan pola-pola pengambilan contoh yang lebih sistematis.

Untuk survei khusus, informasi yang lebih rinci mengenai cara terbaik untuk melakukan survei tersebut harus diperoleh. Pertimbangan-pertimbangan lainnya adalah pemilihan waktu survei dan kelayakan bagian tanaman yang diambil contohnya sebagai indikator penyakit. Untuk informasi lebih lanjut mengenai cara melakukan survei di kawasan Asia-Pasifik dapat mengacu kepada Dr. Teresa McMaugh^[7]) di Office of the Chief Plant Protection Officer (OCPPO), Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry, DAFF.

2          PEMERIKSAAN SPESIMEN

Pemeriksaan spesimen dimulai dengan meneliti sifat-sifat makroskopik yang dapat dilihat dengan mata telanjang dan di bawah mikroskop stereo. Langkah berikutnya ialah menyiapkan kaca obyek dan memeriksa struktur jamur yang mana saja berada di bawah mikroskop ganda. Pada tahap ini, penting untuk mengambil ukuran, membuat gambar, dan jika mungkin membuat potret, terutama apabila patogen tidak dikenal oleh kolektor. Idealnya, catatan, gambar dan potret ini sebaiknya disimpan bersama-sama dengan spesimen herbarium.

2.1       PEWARNAAN JAMUR DAN BAKTERI

Kebanyakan jamur dan bakteri dapat diamati dengan mikroskop di dalam setetes kecil air di bawah kaca penutup. Asam laktat dapat digunakan sebagai medium penempel (mounting) untuk jamur. Seringkali perlu mewarnai jamur yang memiliki struktur hialin. Dua pewarna penting untuk jamur yang berstruktur hialin ialah biru katun (cotton blue) dan lakto-fuksin (lacto fuchsin).

Biru katun (atau biru tripan)
Biru katun (atau biru tripan)	0,1 g
Asam laktat	25 ml
Gliserol	50 ml
Air suling	25 ml

Lakto-fuksin
Asam fuksin	0,1 g
Asam laktat	100 ml

Pengamatan bakteri di dalam jaringan tanaman yang terinfeksi ternyata sangat sulit dilakukan. Penggunaan larutan toluidin biru O 0,1% dalam air membantu penemuan bakteri. Irislah sepotong kecil perbatasan antara jaringan yang sakit dan yang sehat, letakkan pada kaca obyek yang bersih dan tambahkan setetes pewarna. Letakkan kaca penutup di atas preparat dan periksa pada perbesaran 400x. Jika ada, seringkali mungkin untuk melihat bakteri yang bergerak di sekitar pinggir-pinggir jaringan yang diiris. Bakteri berwarna biru tua, sedangkan jaringan tanaman berwarna lebih pucat, biru kehijauan.

Toluidin biru O
Toluidin biru O	0,05 g
Air suling	50 ml

Salah satu pembagian yang penting pada bakteri adalah  antara mereka yang dapat menahan kompleks kristal lembayung (crystal violet) dan yodium terhadap pencucian (elution) dengan etanol (Gram positif) dan mereka yang tidak dapat menahan (Gram negatif). Pewarna Gram penting sebagai penentu ciri utama untuk banyak bakteri tanaman. Zat-zat kimia dan tata cara pewarnaan Gram adalah sebagai berikut:

Larutkan 2 g kristal lembayung ke dalam 20 ml etanol 95%. Larutkan 0,8 g amonium oksalat ke dalam 80 ml air suling. Campurlah kedua larutan itu.

Larutan kristal lembayung
Kristal lembayung	2 g
Etanol 95%	20 ml
Amonium oksalat	0,8 g
Air suling	80 ml

Geruslah yodium dan  kalium yodida bersama-sama, kemudian larutkan ke dalam air dan aduk dalam wadah tertutup selama beberapa jam hingga semuanya larut.

Larutan yodium Lugol
Yodium	1 g
Kalium yodida	2 g
Air suling	300 ml

Buatlah larutan pewarna safranin untuk stok dengan cara melarutkan 2,5 g safranin O ke dalam 100 ml etanol 95%, kemudian encerkan dengan air suling 1:10 untuk digunakan.

Pewarna safranin
Safranin O	2.5 g
Etanol 95%	20 g

Buatlah suspensi keruh sel-sel bakteri dari kultur yang sedang tumbuh aktif (biasanya berumur 24–48 jam) dalam air steril. Oleskan satu lup (ose) penuh suspensi ini ke atas kaca obyek yang bersih. Olesan itu sebaiknya kira-kira 1 cm² sehingga cukup untuk dapat dilihat. Keringkan kaca obyek di udara, kemudian fiksasi dengan cara melewatkan kaca obyek itu beberapa kali di atas nyala api lampu Bunsen. Jangan biarkan kaca obyek menjadi terlalu panas. Fiksasi menjamin bahwa bakteri akan tetap menempel di permukaan kaca obyek selama proses pewarnaan sesudah itu.

Genangi kaca obyek dengan larutan kristal lembayung selama 1 menit. Tuang cairan yang berlebihan dan cuci kaca obyek dengan air keran yang mengalir perlahan hingga tidak ada lagi pewarna yang dengan jelas dihilangkan dari olesan itu. Genangi kaca obyek dengan larutan yodium Lugol selama 1 menit. Kaca obyek dicuci lagi dengan air keran yang mengalir perlahan dan dikeringkan dengan kertas isap. Cucilah dengan etanol 95% yang mengalir perlahan selama beberapa detik (tidak lebih dari 30 detik) untuk menghilangkan pewarna yang mungkin masih ada, dan dikeringkan dengan kertas isap. Lakukan pewarnaan lagi dengan cara menggenanginya dengan larutan safranin selama 20 detik. Cuci lagi dengan air dan keringkan dengan kertas isap. Periksa kaca obyek di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x setelah ditetesi dengan minyak imersi. Bakteri Gram-positif berwarna biru-lembayung, sedangkan bakteri Gram-negatif berwarna merah-merah muda.

Reaksi Gram dapat dikonfirmasi dengan uji kelarutan kalium hidroksida (KOH). Ambillah satu ose penuh kultur bakteri yang sedang tumbuh aktif dan campur dengan setetes larutan KOH 3% di atas kaca obyek yang bersih dan aduk  hingga diperoleh suspensi yang rata. Angkat ose beberapa sentimeter dari kaca obyek. Jika benang lendir bakteri terangkat oleh ose (kira-kira 5-20 mm panjangnya) maka bakteri itu adalah Gram negatif. Jika dihasilkan suspensi berair dan tidak tampak adanya benang lendir setelah ose digerakkan berulang-ulang, maka kultur bakteri itu adalah Gram positif. Perusakan dinding sel organisme Gram negatif yang diikuti dengan pembebasan DNA, yang sangat kental di dalam air, menghasilkan benang lendir. Dinding sel bakteri Gram positif lebih tahan terhadap KOH dan tetap melekat, sehingga tidak ada DNA yang dibebaskan. Uji ini perlu dilakukan bila hasil pewarnaan Gram meragukan.

2.2       MIKROSKOP CAHAYA

Mikroskop stereo berguna untuk pemeriksaan awal spesimen. Mikroskop ganda berkekuatan tinggi yang memberikan perbesaran hingga 1000x diperlukan untuk memeriksa morfologi bakteri dan jamur-jamur mikro.

Untuk memeriksa jamur, sebagian kecil dari jaringan berspora diambil dengan menggunakan mikroskop stereo dengan bantuan jarum penempel atau skalpel runcing dan ditaruh di dalam setetes pewarna, biasanya lakto-fuksin (0,1 g asam fuksin dan 100 ml asam laktat), atau cairan penempel seperti asam laktat  (100 ml asam laktat, 200 ml gliserol dan 100 ml air suling). Jika material tanaman terlalu banyak, sedikit tekanan pada kaca penutup dapat menolong memencarkan struktur menjadi bidang optik yang tipis. Gelembung-gelembung udara dapat dihilangkan dari bantalan (mount) dengan cara melewatkan kaca obyek secara hati-hati di atas nyala api (usahakan agar tidak ada jelaga yang tertinggal di permukaan bawah kaca obyek). Jika kaca obyek dipanaskan terlalu kuat, kaca penutup akan meledak dan terlempar.

Teknik pita perekat sangat berguna terutama untuk memperlihatkan orientasi spora kering, juga rangkaian spora dan bentuk konidiofor. Tahanlah sepotong pita dengan pinset pada koloni jamur atau permukaan daun. Kemudian, pita ditaruh dengan sisi yang lengket di sebelah atas, pada setetes pewarna atau cairan perekat pada kaca obyek yang bersih. Akhirnya kaca penutup ditaruh di atas preparat dan dapat diperiksa di bawah mikroskop.

Beberapa jamur memiliki rangkaian spora yang rapuh, yang mudah berantakan jika udara bergerak sedikit. Kultur kaca obyek  dapat mengatasi masalah ini. Kultur kaca obyek dibuat dengan menggunakan cawan Petri sebagai ruang pelembab yang berisi tabung gelas bengkok yang bersandar pada kertas saring lembab. Sebalok agar-agar steril kira-kira 1 cm² ditaruh pada kaca obyek yang telah disterilkan dengan nyala api yang bersandar pada tabung gelas bengkok itu. Jamur diinokulasikan pada keempat tepi balok agar-agar steril itu dan sebuah kaca penutup steril ditaruh di atasnya. Setelah beberapa hari, kaca obyek itu dapat ditempelkan pada mikroskop, dan struktur-struktur jamur yang tidak terganggu diamati ketika mereka tumbuh. Balok agar-agar kemudian dapat dikeluarkan dan dua bantalan (mount) kaca obyek konvensional dibuat dari kaca obyek dan kaca penutup. Jika dibiarkan kering sebelum hal ini dilakukan, maka kecil kemungkinannya struktur-struktur jamur itu akan hancur.

Untuk beberapa patogen, hubungan tempat antara tubuh buah dan jaringan inang, atau letak konidiofor di dalam tubuh buah, merupakan ciri-ciri taksonomi yang penting. Irisan-irisan jaringan yang tipis memungkinkan struktur-struktur ini dapat dilihat di bawah mikroskop. Irisan-irisan jaringan dapat dibuat dengan tangan menggunakan skalpel di bawah mikroskop stereo atau dengan mikrotom yang canggih. Mikrotom beku khususnya berguna  untuk memotong tipis hingga agak tipis irisan-irisan jaringan beku yang segar. Mikrotom beku biasanya dilengkapi dengan panggung (stage) tempat jaringan dibekukan secara thermoelektrik atau dengan pendingin yang mengedarkan ulang suhu rendah.

Bakteri seringkali sulit untuk diamati di dalam jaringan yang terinfeksi. Penggunaan Toluidin Biru O dapat mempermudah penemuan bakteri. Pewarnaan Gram berguna untuk membedakan dua kelompok bakteri yang berbeda dalam sifat-sifat biokimianya, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Sel-sel bakteri Gram positif berwarna ungu tua, sedangkan sel-sel bakteri Gram negatif berwarna merah.  Informasi yang lebih banyak tentang teknik ini dapat dilihat dalam Bab 7. Identifikasi patogen.

Mempertahankan kualitas optik suatu mikroskop memerlukan perawatan yang teratur. Tiap mikroskop sebaiknya diservis setiap 6–12 bulan. Di lingkungan tropik yang lembab, jamur dapat tumbuh pada lensa dan permukaan optik, sehingga mempengaruhi kualitas optik mikroskop, dan merusak permukaan-permukaan ini secara permanen apabila dibiarkan tidak diperiksa. Di daerah tropik, semua mikroskop sebaiknya disimpan di dalam ruangan ber-AC dan dengan alat pengering udara.

Penyimpanan mikroskop di dalam ruangan ber-AC tidak cukup mengurangi kelembaban untuk mencegah tumbuhnya jamur. Suatu cara selain menggunakan alat pengering udara komersial ialah dengan menyimpan mikroskop di dalam lemari berpengering udara atau dalam ‘kotak panas’, bila tidak digunakan. ‘Kotak panas’ adalah kotak kayu atau plastik yang cukup besar untuk menyimpan mikroskop dan bola lampu 25 W. Sebaiknya kotak cukup rapat, sehingga udara tidak dapat masuk. Bola lampu bertindak sebagai alat pengering udara dengan memberikan cukup banyak panas untuk menurunkan kelembaban di dalam kotak, dan menjaga kotak itu beserta isinya agar tetap kering. Perlengkapan kamera di daerah tropik sebaiknya juga disimpan di dalam ‘kotak panas’.

2.3       PEMOTRETAN

Jika mungkin, buatlah potret (gambar terawang berwarna atau  gambar digital) spesimen penyakit tanaman selama pengumpulan di lapangan. Membuat potret di lapangan akan memberi kesempatan kepada anda untuk membangun koleksi acuan gambar mengenai gejala-gejala penyakit tanaman seperti yang terjadi di alam. Buatlah sejumlah potret dan pilihlah beberapa yang terbaik sewaktu anda mencetak atau men’download’nya (dalam kasus gambar digital). Juga disarankan untuk menyimpan buku catatan harian (yaitu yang mencatat rincian koleksi spesimen untuk setiap gambar) guna menghindari keragu-raguan bila telah sampai kembali di laboratorium.

Pembuatan potret spesimen penyakit tanaman di laboratorium memberi kesempatan pengendalian yang lebih banyak terhadap kondisi lingkungan meskipun mungkin diperlukan pencahayaan tambahan. Sayangnya, cahaya buatan dapat juga menciptakan bayangan-bayangan yang tidak dikehendaki. Abu-abu muda merupakan latar belakang yang terbaik untuk potret, latar belakang hitam dan putih dapat menghasilkan pencahayaan yang kurang atau berlebih terhadap benda yang dipotret.

Gambar digital gejala penyakit tanaman sangat berguna, karena dapat dikirimkan kepada rekan sejawat dengan cepat, dan tidak mudah mengalami kemunduran seperti film negatif  atau gambar terawang, yang dapat menjadi tertutup oleh pertumbuhan jamur, khususnya di daerah tropik. Gambar-gambar digital dapat diambil secara langsung dari sumbernya yaitu kamera digital, sken (scan) dari potret berwarna atau gambar terawang, atau bahkan langsung dari spesimen.

2.3.1        Pemberian nama dan pengelolaan berkas catatan

Kamera digital secara otomatis memberi nama-nama yang unik untuk berkas-berkas catatan (files) gambar, misalnya IMG_001.jpg, dan DSCF0001.jpg. Nama-nama ini seringkali tidak ada artinya sewaktu membaca-baca berkas catatan di komputer. Akses ke perangkat lunak pengelolaan gambar (lihat bawah) dapat mengatasi masalah ini, sebagaimana halnya dengan penamaan ulang berkas-berkas catatan gambar.  Nama-nama berkas catatan yang deskriptif sebaiknya digunakan dalam pemberian nama, misalnya ‘antraknos pada mangga.jpg’.

Jika koleksi gambar digital anda banyak, maka gunakan nomor-nomor juga untuk membantu mengkatalog gambar-gambar itu. Jangan lupa untuk menggunakan angka-angka nol di depan nomor misalnya 001 untuk 1, karena perangkat lunak komputer seringkali akan menyortir 100 sebelum 99. Jika gambar itu memperlihatkan gejala-gejala dari spesimen herbarium yang sesungguhnya, maka yang termudah adalah menggunakan nomor tambahan spesimen herbarium sebagai nama berkas catatan untuk gambar tersebut.

Yang terbaik adalah tidak menyimpan terlalu banyak berkas catatan di dalam satu folder. Jika terdapat banyak sekali berkas catatan, akan diperlukan banyak waktu untuk mencari satu gambar tertentu. Buatlah folder-folder untuk proyek-proyek baru dan bagilah menurut patogen, inang, negara atau tanggal. Salah satu cara terbaik untuk mengatur gambar ialah dengan menggunakan salah satu dari banyak paket perangkat lunak yang ada untuk mengelola gambar. Program-program ini memungkinkan anda untuk mengatur gambar-gambar, menambah pertelaan, menciptakan cetakan tempel dan  penyajian gambar terawang serta memprosesnya untuk setiap kumpulan, sehingga dapat dimuat dalam jaringan internet. Ada aneka rupa perangkat lunak pengelolaan gambar yang dapat digunakan untuk:

Ø   Memperoleh gambar dari kamera;

Ø   Melihat gambar;

Ø   Mengkatalog gambar;

Ø   Menyunting gambar; dan

Ø   Mengirim gambar dalam ukuran kecil ke jaringan internet.

Beberapa perangkat lunak pengelolalan gambar yang tersedia sekarang ini ialah: Ablaze Image Manager, ThumbsPlus, Cumulus, Epson’s File Factor, Piccolo, Photo Wallet, Polybites Polyview, Thumber, PIE, ACDSee (PC and Mac), PicaView32, Image Fox, Graphic Workshop, Professional, GraphicConverter, Power Browser, IrfanView32, Photopage, Quisknailer, Compupic, Image Viewer, Photo Recall, Photo Explorer, EXIFRead, VuePrint, ImageAXS, iView Multimedia, Compupic Pro, Sony PictureGear, FlipAlbum, PictureWorks MediaCenter, JASC Media Center, Pictureshow, Qpict Media Organizer and DigiPics.

---

^[7])    Dr. McMaugh sedang mengkoordinasi penerbitan buku Guidelines for Plant Pest Surveillance in Asia and the Pacific yang dibiayai oleh Australian Centre for International Agricultural Research (ACIAR) dan Rural Industries Research and Development Corporation (RIRDC).