TUGAS BIOTEKNOLOGI
”ELEKTROFORESIS DNA”
OLEH Kelompok 2:
1) DIVYA RANI
2) REZZA TIA UNTARI
3) KIKI REZEKI
4) IRFAN PASARIBU
PROGRAM STUDI BIOLOGI
PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETHUAN ALAM
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNUVERSITAS JAMBI
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).
Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.
1.2. Tujuan
Untuk mengetahui alat-alat yang digunakan dalam proses elektroforesis
dan cara penggunaanya.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:
- Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
- Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
- Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
- Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.
Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
- Kekuatan voltase
Ø Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
Ø Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6.Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah.
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.
Elektroforesis DNA
Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1).
Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.
Gambar 1. Elektroforesis DNA dengan gel agarosa
Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.
DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).
Pulsed field gel electrophoresis
Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis
Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama.
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 3).
Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.
Gambar 3. Situs pengenalan enzim restriksi
Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.
Gambar 4. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi
Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Enzim restriksi tidAk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 5).
Gambar 5. Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik
DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.
Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia. Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya. Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6.
Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. Mereka tampak ‘smear’. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat. Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 6).
Gambar 6. Hasil probing DNA
Kloning DNA
Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.
Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1) Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2) Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi
3) Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).
Gambar 7. Kloning DNA dalam plasmid vektor
Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8).
Gambar 8. Pembentukan DNA library
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’. ‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).
Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.
Gambar 9. Pembentukan cDNA
Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library
Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing.
Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul
BAB III
ALAT DAN METODE
3.1 Alat yang digunakan
Alat yang digunakan dalam metode elektroforesis :
1) tabung eppendorf,
2) mikropipet,
3) mortar
4) tabung erlenmeyer,
5) gelas ukur,
6) penangas air (dengan suhu 800C),
7) magnetic stirer,
8) magnetic bar,
9) sentrifuga,
10) pinset, timbangan, pompa vacum, citakangel 20x16x1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer, kawat halus,
11) inkubator, power supply, pisau, penggaris, spidol, kantong plastik tebal, nampan plastik, spon dan alat-alat tulis.
3.2 Bahan yang digunakan
Bahan kimia yang digunakan tergantung dari hewan atau tumbuhan enzim apa yang akan diuji. Misalnya larutan pengekstra yang digunakan untuk jenis udangudangan adalah enzim esterase, malat, phosphat glukosa isomerase.
3.3. Metode
Cara kerja metode elktroforesis adalah sebagai berikut:
- Ektraksi enzim
Setelah sampel dibersihkan ditempatkan didalam mortal dan diberi pengestrak sebanyak ± 200 (tergantung dari banyaknya, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel) kemudian smpel digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (± 4 0C) dan dilakukan didalam meja pendingin. Agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan kedalam tabung eppendrof dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan yang selanjutnya dimasukkan dalam tabung eppendof yang disimpan dalam lemari pendingin (freezer) dalam suhu sekitar 70 0C.
- Pembuatan gel
Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan
- Penempatan sampel
Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak enzim. Ekstar enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipet mikro. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.
4. Proses Elektroforesis
1) Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C.
2) Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutan penyangga elektroda dengan gel.
3) Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin.
4) Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam.
5) Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis.
6) Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.
5. Visualisasi sistem enzim
Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan pancaran sinar Ultraviolet.
6. Metode Analisis
Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yang ada dalam suatu populasi.
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1. Kesimpulan
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.
Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah:
1) Ektraksi enzim,
2) Pembuatan gel,
3) Penempatan sampel,
4) Proses Elektroforesis,
5) Visualisasi sistem enzim dan
6) Metode Analisis.
pertama tahapan preparasi sampel yang meliputi pengambilan sampel DNA (isolasi) dan pemurnian DNA. Dalam tahap ini diperlukan kesterilan alat-alat yang digunakan. Untuk sampel darah, dalam isolasinya dapat digunakan bahan kimia phenolchloroform sedangkan untuk sampel rambut dapat digunakan bahan kimia Chilex.
Selanjutnya DNA dimurnikan dari kotoran-kotoran seperti protein, sel debris, dan lain lain. Untuk metode pemurnian biasanya digunakan tehnik sentrifugasi dan metode filtrasi vakum. Tetapi berbagai ilmuwan telah banyak meninggalkan cara tersebut dan beralih ke produk-produk pemurnian yang telah dipasarkan seperti produk butir magnet dari Promega Corporation yang memanfaatkan silica-coated paramagnetic resin yang memungkinkan metode pemisahan DNA yang lebih sederhana dan cepat.
Tahapan selanjutnya adalah memasukan sampel DNA yang telah dimurnikan kedalam mesin PCR (polymerase chain reaction) sebagai tahapan amplifikasi.
Hasil akhir dari tahap amplifikasi ini adalah berupa kopi urutan DNA lengkap dari DNA sampel. Selanjutnya kopi urutan DNA ini akan dikarakterisasi dengan elektroforesis untuk melihat pola pitanya. Karena urutan DNA setiap orang berbeda maka jumlah dan lokasi pita DNA (pola elektroforesis) setiap individu juga berbeda. Pola pita inilah yang disebut DNA sidik jari (DNA finger print) yang akan dianalisa pola STR nya. Tahap terakhir adalah DNA berada dalam tahapan typing, proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipe DNA. Mesin PCR akan membaca data-data DNA dan menampilkannya dalam bentuk angka-angka dan gambar-gambar identfikasi DNA. Finishing dari tes DNA ini adalah mencocokan tipe-tipe DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim.2008. http.d4him.files.wordpress.com.Tanggal akses 13 Agustus 2010
Anonim.2009.http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular. Tanggal akses 13 Agustus 2010
Anonim.2009.http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular. Tanggal akses 13 Agustus 2010
Anonim.2009.http.ioppijepang.org Tanggal akses 13 Agustus 2010
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.
Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang
Zubay, G. L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar