Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .[1] Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. [2] Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. [2] Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.[2] Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. [3]
Jenis elektroforesis
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. [4] Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. [4] Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. [5]
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. [6] Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. [6] Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. [6]
Referensi
- ^ (en) Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. New Jersey: John Wiley & Sons inc.
- ^ a b c d Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.
- ^ Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press
- ^ a b Sulaiman, Hardi A & Kundari NA. 2007. Pemisahan dan karakterisasi spesi senyawa kompleks ytrium-90 dan sstronsium-90 dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1 No.2
- ^ Khopkar SM. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.
- ^ a b c Yepyhardi. 2009. Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular. Sciencebiotech.net[web]. http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular
Elektroforesis
Posted by admin on Friday, June 19, 2009 · 2 Comments
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran.
Elektroforesis Protein
Seperti halnya dengan elektroforesis DNA, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit.
Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu bagian electric transformer yang mengubah arus AC ke DC dan bagian tanki elektroforesis yang berisi flat bed, slab, column, dan selang.
Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein :
1. Densitas muatan molekul - berbeda diantara pH media dan pl molekul.
2. Pengaruh buffer
- pH - akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi tingkat dan arah pergerakannya
- Kekuatan ionik - mempengaruhi tingkat pemisahan
- Komposisi - bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein.
3. Bentuk dan ukuran molekul
4. media pendukung
- Restriksi pada mobilitas
- Pengaruh difusi
- Elektroendosmosis
- Mikro-heterogenitas molekuler spesies
Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE)
Sistem yang digunakan dalam PAGE
- Flat Bed
- Rod atau Column
- Vertical Slab
- Capillary
Faktor yang mempengaruhi resolusi
1. Konsentrasi Gel Poliakrilamid
- Konsentrasi monomer - proporsional terhadap porositas gel akhir
- Persentase Cross-linker pada Monomer - mempunyai pengaruh pada porositas gel akhir
- kimia alam untuk Cross-linker - dapat mempengaruhi porositas dan penangan selanjutnya pada gel akhir
- Kemurnian monomer - sering terkontaminasi dengan asam akrilat yang menyebakan efek elektroendosmosis pada gel final.
2. Buffer
- pH
- Penggunaan sistem buffer kontnyu atau diskontinyu
- Komposisi buffer
- Inklusi agen disosiasi : Urea, detergen non ionic, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)
Buffer sistem
Buffer ini dapat digunakan dengan atau tanpa SDS meskipun inklusi SDS sering umum digunakan belakangan ini. Laemmli Buffer - Tris, Glycine HCl buffer - adalah buffer yang banyak digunakan secara luas terutama dengan SDS. Resolusinya sangat jelek dengan ukuran MW dibawah 10KDa.
Schaegger & Von Jagow Buffer system - Tricine, Tris , HCl buffer - dengan komposisi gel yang benar sistem buffer ini dapat menguraikan peptida hingga 1 KDa dan umumnya memberikan memberikan reolusi yang lebih baik hingga 100 KDa.
Penggunaan agen disosiasi
1. Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)
- Resolusi pemisahan tinggi
- Estimasi berat molekuler
2. Urea atau Detergen Non Ionik (Tween 20)
Membantu melarutkan material yang tidak larut dalam media cair seperti protein membran sel
Struktur Protein
Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh interaksi elektrostatik dan hidrofobik, sekaligus juga gaya yang lebih kuat seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier protein.
Teknik elektroforesis
Untuk mempelajari protein, kita perlu mengurutkan dan memvisualisasikannya. Salah satu cara paling umum untuk melakukannya dikenal dengan SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis).
Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul bermuatan melalui matriks atau gel. Pada laboratorium sederhana kita bisa menggunakan gel agarose utnuk memisahkan fragmen DNA. Dalam kasus ini, kita memerlukan matriks yang terang/bening untuk memisahkan molekul. Matriks yang bening ini terbuat dari polimer akrilamid. Sehingga PAGE diartikan sebagai proses pemisahan protein dalam sebuah gel akrilamid melalui aplikasi arus listrik. Seperti halnya pada elektroforesis DNA, molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel.
Tidak seperti DNA, protein yang diisolasi ini tidak akan memiliki muatan negatif yang sama. Karena itu perlu untuk melindungi semua protein dengan sesuatu untuk memberikan muatan negatif, yang memungkinkan mereka bergerak menuju ujung positif arus listrik.
Untuk memisahkan protein secara akurat berdasarkan ukurannya, akan sangat penting jika kita mendenaturasi protein sebelum mengisikannya dalam gel. Untuk melakukan hal ini, kita akan menggunakan loading buffer dengan 2 bahan penting, SDS dan DTT (ditiotreitol). DTT adalah agen pereduksi yang kuat yang memutus ikatan disulfida. Selain itu untuk mempergunakan 2 agen kimia untuk mendenaturasi protein, kita juga harus memanaskan beberapa sampel hingga 95oC untuk membantu mendenaturasi protein secara sempurna, menghasilkan molekul linier yang akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya.
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
Elektroforesis dengan Kertas Saring
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis Gel Kanji
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
- Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
- http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html
Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19).
Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994: A-6).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7).
PCR
Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe 1993: 137). PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi (Davis et al. 1994: 114). Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan (Wolfe 1993: 137).
Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu:
1. Denaturasi
adalah proses penguraian materi genetik (DNA/RNA) dari bentuk heliksnya yang dipisahkan dengan suhu 90-96oC.
2. Annealing (pelekatan) atau hibridisasi
adalah suatu proses penempelan primer ke DNA template yang sekarang hanya dalam satu untai.
3. Polimerisasi (sintesis)
adalah suatu proses pemanjangan rantai DNA baru yang dimulai dari primer.
Aplikasi dari PCR yaitu:
1. Mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen (Powledge 2001: ?).
2. Untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal (Powledge 2001: ?).
3. DNA atau RNA yahg telah dianalisis dengan menggunakan teknik PCR digunakan untuk meneliti penerapannya dalam bidang klinik dan obat-obatan forensik, mengembangkan teknik-teknik dalam bidang genetika dan untuk mendiagnosa (Davis et al. 1994: 114).
4. Untuk membuat cDNA library, yaitu sebuah set dari hasil kloning yang mewakili sebanyak mungkin mRNA dari suatu tipe sel tertentu dengan waktu tertentu. Pembuatan cDNA library tersebut menggunakan teknik Transverse Replication PCR (Weaver 1999: 80).
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Brown, T. A. 1992. Genetics: A molecular approach. 2nd ed. Chapman & Hall, London: xxii + 467 hlm.
Wolfe, S.L. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont: xviii + 1145 hlm.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Powledge, T.M. 2001. The polymerase chain reaction. 7 September: ? hlm. http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html, 30 November 2005, pk. 17. 43.
Weaver, R.F. 1999. Molecular biology. McGraw-Hill Companies Inc., Boston: xvii + 787 hlm.
3 komentar:
Good blog, helpful gan. . . thankz
Good blog, helpful gan
Salam kenal, saya mau tanya, apakah elektroforesis bisa digunakan untuk bakteri yang beragam dalam satu sampel itu?
Posting Komentar